肖 瀟,李忠玲,3,張紅艷,2,張 強,3,吳雪利,胡云紅,2,岳淑寧,2*

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710043；3.中國科學(xué)院西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西 西安 710043； 4.臨潼區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710600)

近年來頻繁爆發(fā)動物疫情和食品安全問題，使得發(fā)展安全、綠色養(yǎng)殖業(yè)成為當(dāng)務(wù)之急，無污染、無殘留的飼料添加劑受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，例如飼用酶制劑[1]。其中，纖維素酶具有分解纖維素和半纖維素的能力[2]，促進動物對飼料的消化吸收，緩解腸道壓力，減輕抗?fàn)I養(yǎng)因子對動物產(chǎn)生的不良影響[3]，已被廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖業(yè)中[1]。

中國2013年全國抗生素用量16.2萬噸，其中獸用抗生素占據(jù)其中的52%。而且在使用抗生素的豬養(yǎng)殖場中，研究人員在豬的糞便中檢測出多個獨特的多拷貝抗生素抗性基因[4]，抗生素的過度使用已成為養(yǎng)殖業(yè)的一大難題，而具有抑菌作用的益生素(也稱為益生菌)以其無污染、無殘留、安全等優(yōu)點成為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要助力[5]。益生素可以產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)和消化酶，調(diào)節(jié)動物腸道環(huán)境，維持腸道微生態(tài)平衡，提高動物對飼料的吸收和利用，預(yù)防疾病的發(fā)生[6]。酪酸菌能夠與雙歧桿菌、乳酸菌、糞桿菌等腸道有益菌共生，并促進有益菌生長繁殖；還能夠產(chǎn)生具有抗菌功能的有機酸，抑制病原菌的生長繁殖，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌、魏氏梭菌等[7]。地衣芽孢桿菌也具有拮抗病原菌的功能，能夠維持和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，提高動物的抗病能力[8]，還可為動物提供蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、氨基酸、維生素等，調(diào)節(jié)養(yǎng)分代謝[9]。

酪酸菌和地衣芽孢桿菌分別屬于厭氧和好氧菌，具有不同的酶系。本研究利用酪酸菌和地衣芽孢桿菌代謝過程中的復(fù)合酶系和纖維素酶功能的疊加，在試驗條件下探究其作為奶牛復(fù)合飼料添加劑的應(yīng)用效果，并為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗?zāi)膛?、酶與菌種

按照同質(zhì)原則，選擇體重、泌乳月、產(chǎn)奶量基本一致的健康奶牛40頭，隨機分為4組，每組10頭；試驗用纖維素酶購自寧夏某公司，活力為10 000 U/g，最適pH 5.5，在pH 4.5～7.5范圍內(nèi)具有較高的酶活性，在奶牛腸道中可發(fā)揮較好的酶學(xué)作用；試驗用酪酸菌(Clostridiumbutyricum)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)均為陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所保存，菌劑生產(chǎn)采用液體發(fā)酵，噴霧干燥制作。

1.2 飼喂配方

奶?；A(chǔ)日糧配方見表1。

表1 奶?；A(chǔ)日糧配方

本試驗所使用的抗病性綠色飼料添加劑的組成主要包括地衣芽孢桿菌、酪酸菌和纖維素酶，其中酪酸菌和地衣芽孢桿菌活菌數(shù)均為20×108/g。

1.3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)3個試驗組和1個對照組，具體分組情況見表2。所有奶牛的棚舍條件及管理方式均保持一致。本試驗采用單因素4水平隨機分組的試驗設(shè)計，預(yù)試期10 d，正式試驗期80 d，從2017年9月到2017年11月，在西安市臨潼區(qū)陽光牧業(yè)有限責(zé)任公司進行。

表2 試驗分組設(shè)計

1.4 指標測定及記錄

試驗開始后觀察牛的生長發(fā)育情況，記錄健康狀況。分別記錄各組奶牛每天的產(chǎn)奶量，并在第90天測定牛奶的各項指標，包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、全脂乳固體含量、非脂乳固體含量和體細胞數(shù)目[11]。在整個飼養(yǎng)過程中記錄奶牛腸道炎的發(fā)病情況。體細胞計數(shù)采用體細胞記數(shù)儀(Somacount 150)進行。

1.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對牛奶產(chǎn)量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、全脂乳固體含量、非脂乳固體含量和體細胞數(shù)目進行單因素方差分析，采用Tukey法進行差異顯著性比較，結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性飼料添加劑對奶牛產(chǎn)奶量的影響

抗病性飼料添加劑對奶牛產(chǎn)奶量的影響結(jié)果見表3。試驗前，四組奶牛的產(chǎn)奶量無顯著差別(P>0.05)；在試驗的不同時間段，試驗2組和試驗3組的產(chǎn)奶量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照組。其中，第30～45天分別提高了6.88%和6.79%，第45～60天提高了6.92%和7.70%，第60～75天提高了8.66%和9.89%，第75～90天提高了10.13%和10.69%。同一組奶牛在試驗的不同時間段之間產(chǎn)奶量均無顯著差異(P>0.05)，但隨著時間的推移，試驗2組和試驗3組產(chǎn)奶量提高率略有增加。

表3 日均產(chǎn)奶量統(tǒng)計結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)比較結(jié)果用a～d表示，同行數(shù)據(jù)比較結(jié)果用m～q表示。肩標為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes: The results of comparison in the same column are represented by a～d, while the results in the same row are represented by m～q. In the same column(row), values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01).

2.2 抗病性飼料添加劑對牛乳品質(zhì)的影響

奶牛日糧添加抗病性飼料添加劑后牛乳主要營養(yǎng)指標見表4。由表4知，試驗2組的乳脂率極顯著低于試驗1組和對照組(P<0.01)；試驗1組的乳蛋白率顯著高于試驗2組和3組(P<0.05)；試驗1組和試驗3組的乳糖含量顯著高于對照組(P<0.05)；添加抗病性飼料添加劑對牛乳中的全脂乳固體和非脂乳固體含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 牛乳品質(zhì)指標

注：同行數(shù)據(jù)肩標為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Notes: In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same below.

2.3 抗病性飼料添加劑對牛乳中體細胞數(shù)的影響

奶牛日糧中添加抗病性綠色飼料添加劑對牛乳中體細胞數(shù)的影響見表5。由表5可知，與對照組相比，試驗2組和3組的體細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),試驗1組與對照組的差異不顯著(P>0.05)。試驗1、2、3組的體細胞數(shù)減少率分別達到9.36%、28.26%、23.72%。

2.4 抗病性飼料添加劑對奶牛腸炎發(fā)病率的影響

奶牛日糧中添加抗病性綠色飼料添加劑對奶牛腸炎發(fā)病率的影響見表6。由表6可知，對照組奶牛腸炎發(fā)病率為60%，試驗1組的腸炎發(fā)病率降至20%，試驗2組和3組的腸炎發(fā)病率均降至10%。

表5 牛乳中體細胞數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

表6 奶牛腸炎發(fā)病率統(tǒng)計

3 討 論

3.1 抗病性飼料添加劑對奶牛生產(chǎn)的調(diào)節(jié)

試驗結(jié)果顯示，添加0.10%和0.15%的抗病性飼料添加劑可顯著提高牛乳產(chǎn)量，隨時間推移牛乳產(chǎn)量的提高率逐步上升，說明本抗病性飼料添加劑對奶牛產(chǎn)奶量具有持續(xù)的促進效果，該結(jié)果與Kritas等[10]在日糧中添加地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合益生素時綿羊產(chǎn)奶量顯著增加的研究結(jié)果一致。周振峰[11]研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑65 d后，奶牛的產(chǎn)奶量最多可提高5.8%。本試驗在使用添加劑60 d后奶牛的產(chǎn)奶量最多可提高9.89%，說明本研究所采用的復(fù)合型添加劑對產(chǎn)奶量的促進效果優(yōu)于單獨使用地衣芽孢桿菌。通過在飼料中添加復(fù)合型添加劑提高了奶牛的產(chǎn)奶量，其原因可能是由于地衣芽孢桿菌為機體提供了蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，與纖維素酶和酪酸菌共同作用提高了飼料的利用率。對乳成分分析結(jié)果表明，使用抗病性飼料添加劑對乳脂率、乳蛋白率、全脂乳固體和非脂乳固體含量均無明顯改善作用，僅對乳糖含量有顯著提升，說明雖然使用抗病性飼料添加劑能夠提升牛奶產(chǎn)量，但對乳品質(zhì)無改善作用，這與地衣芽孢桿菌添加劑對奶牛泌乳的影響結(jié)果相似[11]。

3.2 抗病性飼料添加劑對奶牛健康的影響

研究表明地衣芽孢桿菌和酪酸菌作為益生菌能夠加強腸道屏障、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，還能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，預(yù)防腹瀉、高膽固醇血癥、炎癥性腸炎，促進乳糖的利用和礦物質(zhì)的吸收[12]。Lan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，和飼喂基礎(chǔ)日糧的豬相比，添加含有地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生素添加劑能提高豬糞便中的乳酸菌數(shù)量，同時降低糞便中大腸桿菌數(shù)量、NH3和H2S排放，改善了腸道微環(huán)境，促進腸道健康。Wang等[14]的研究也表明在日糧中添加地衣芽孢桿菌能夠顯著增加奶牛瘤胃pH、氨態(tài)氮和異戊酸的濃度，減少甲烷的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腸胃的微生物平衡，改善腸胃環(huán)境。在日糧中添加含有酪酸菌的益生素添加劑時，奶牛瘤胃的pH更加穩(wěn)定[6]，在對腸道應(yīng)激綜合癥患者進行酪酸菌治療后，腸道菌群中的雙歧桿菌、無芽孢厭氧菌、大腸桿菌、腸球菌和乳酸菌恢復(fù)到健康水平，潛在的致病菌減少[15]。本研究所使用的復(fù)合型添加劑同時含有地衣芽孢桿菌和酪酸菌，因此，在一定程度上調(diào)節(jié)了奶牛的腸道菌群，改善了腸道健康，從而降低了腸炎發(fā)病率。而且本研究結(jié)果顯示，該飼料添加劑對奶牛隱性乳腺炎具有一定的預(yù)防效果。地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制潛在的乳腺炎病原菌[16]，在針對人體的研究中也發(fā)現(xiàn)，口服益生菌能夠有效的控制乳腺炎，其中的潛在機制雖然不清楚，但結(jié)果表明患乳腺炎的奶牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與乳汁相似，其中乳腺炎相關(guān)病原菌數(shù)量都顯著上升，而乳酸桿菌的數(shù)量都呈下降趨勢，說明奶牛腸道微環(huán)境的平衡與乳腺健康有重要聯(lián)系[17]。目前將地衣芽孢桿菌、酪酸菌與纖維素酶混合作為復(fù)配飼料添加劑的研究還較少，本研究將這兩種微生物與纖維素酶混合，探究其對奶牛健康和生產(chǎn)的影響，為以后的生產(chǎn)實踐提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

根據(jù)試驗結(jié)果，添加0.10%、0.15%的添加劑對減少牛乳中的體細胞數(shù)和緩解腸炎的患病率效果顯著。其中添加0.10%的添加劑能夠?qū)⑴Ｄ讨械捏w細胞數(shù)目降到20.23萬個/mL，低于添加0.15%的添加劑的體細胞數(shù)。而且在添加0.10%和0.15%的添加劑時，奶牛的腸炎患病率均為10%，牛奶的產(chǎn)量也無顯著差別，綜合考慮，添加0.10%的益生素和酶復(fù)合制劑時效果最好，且成本較低。