馬 莎 張繼紅 劉 毅 吳文廣 孫 科 王 巍 隋娟娟 趙云霞 楊艷云

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家試驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

海水酸化是由全球氣候變化導(dǎo)致的一種海洋環(huán)境變化，已成為一個(gè)世界性的環(huán)境問(wèn)題和當(dāng)今的研究熱點(diǎn)(Riebesellet al, 2007)。關(guān)于海水酸化對(duì)浮游植物的生長(zhǎng)、光合作用、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響已有報(bào)道(高坤山, 2011； 毛雪微等, 2016； 徐金濤等,2016； Honget al, 2017)，但由于海洋藻類對(duì)大氣CO2濃度升高的響應(yīng)存在明顯的種間異質(zhì)性，不同種類浮游植物，甚至同一種類在不同培養(yǎng)條件下對(duì)酸化的響應(yīng)均不同。同時(shí)，浮游植物作為濾食性貝類的主要餌料，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于被攝食的難易程度(粒徑的大小)和生化組成等(陳自強(qiáng)等, 2013)，而生物體發(fā)育過(guò)程中大分子的組成及其化學(xué)計(jì)量的變化都會(huì)反映到元素比率上(Laspoumadereset al, 2010； 陳蕾等,2014)，浮游植物的元素組成會(huì)影響其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂肪酸等)的含量(Sterneret al, 2002)，進(jìn)而影響其作為食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。關(guān)于海水酸化對(duì)不同種類浮游植物生物組成的研究較少(Rossollet al, 2012；Schooet al, 2013)，因此，開(kāi)展CO2濃度升高對(duì)不同類別餌料藻細(xì)胞數(shù)量(生長(zhǎng)、光合)和質(zhì)量(營(yíng)養(yǎng)元素含量比值)影響的比較研究是非常必要的。本研究采用室內(nèi)可控實(shí)驗(yàn)方法，以不同粒徑、不同種類的4種餌料藻：叉鞭金藻(Dicrateriasp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)為研究對(duì)象，測(cè)定了CO2濃度升高對(duì)其生長(zhǎng)、單位細(xì)胞葉綠素a含量、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)及營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的影響，以期為進(jìn)一步從食物鏈角度研究海水酸化對(duì)濾食性貝類及海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用藻種叉鞭金藻、三角褐指藻、小球藻和亞心形扁藻，均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生態(tài)與技術(shù)研究室提供。

實(shí)驗(yàn)設(shè)定低 CO2濃度組(403×10-6)和高 CO2濃度組(1600×10-6)，相當(dāng)于當(dāng)前和 2300年大氣平均 CO2濃度預(yù)測(cè)水平(Caldeiraet al, 2003； Stockeret al, 2013；Dlugokenckyet al, 2017)。CO2濃度采用植物培養(yǎng)箱(HP1000G-D, 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)來(lái)控制(毛雪微等, 2016)。實(shí)驗(yàn)所用容器為3 L錐形瓶，加入2 L f/2培養(yǎng)液，接入指數(shù)生長(zhǎng)期的微藻，初始濃度為5～10×104cells/ml。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置3個(gè)平行，初始 pH為8.2和7.6。光暗比(L/D)為 12 h∶12 h，溫度為(20.0±0.5)℃，光照為 80 μmol/(m2·s)，每天定時(shí)搖動(dòng)4～6次。實(shí)驗(yàn)持續(xù)13 d，每隔1 d測(cè)定藻細(xì)胞濃度和藻體的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，培養(yǎng)7 d后測(cè)定藻體的C、N和P含量。葉綠素a含量按照海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范GB 17378.7-2007進(jìn)行。

1.2 藻細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)及比生長(zhǎng)速率計(jì)算

取樣10 ml，用Beckman Coulter Multisizer Ⅲ顆粒計(jì)數(shù)器測(cè)定藻細(xì)胞濃度。根據(jù)以下公式計(jì)算比生長(zhǎng)速率(μ)：

式中，N1為第t1天藻細(xì)胞密度(cell/ml)；N2為第t2天藻細(xì)胞密度。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

利用 Imaging-PAM 調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對(duì)藻進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。測(cè)量前將浮游植物樣品暗適應(yīng) 20 min，每個(gè)平行重復(fù) 2次。采用Platt等(1980)提出的雙指數(shù)衰減函數(shù)對(duì)快速光曲線(RLC)進(jìn)行擬合：

其中，P為相對(duì)電子傳遞速率，Pm為無(wú)光抑制時(shí)的最大潛在相對(duì)電子傳遞速率rETRmax，PAR為光照強(qiáng)度，α為快速光曲線的初始斜率，β為光抑制參數(shù)。

1.4 C、N和P含量測(cè)定

取一定體積的藻液，離心收集(3000 r/min 10 min)，烘干至恒重。將樣品研磨成粉狀混合均勻，取2 mg用元素分析儀(Elemental Analyzer Vario EL cube, 德國(guó)Elementar)測(cè)定藻體 C、N 含量；按照周毅等(2003)方法測(cè)定藻體P含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)組間組內(nèi)差異，P＜0.05視為差異顯著，P＜0.01視為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 4種浮游植物細(xì)胞生長(zhǎng)及比生長(zhǎng)速率

不同CO2濃度下亞心形扁藻、小球藻、叉鞭金藻和三角褐指藻的生長(zhǎng)曲線以及比生長(zhǎng)速率如圖 1所示?？傮w來(lái)講，CO2濃度升高可顯著提高4種藻的生長(zhǎng)及比生長(zhǎng)速率(P＜0.05)，但不同種類的變化幅度不同。從比生長(zhǎng)速率來(lái)看，亞心形扁藻的反應(yīng)最為迅速，與對(duì)照組相比，差異達(dá)到極顯著(P＜0.01)，其最大比生長(zhǎng)速率為0.590/d，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間平均比生長(zhǎng)速率(0.233/d)比對(duì)照組(0.205/d)高出13.5%；同時(shí)，高 CO2濃度組的藻體細(xì)胞濃度顯著高于低 CO2濃度組(圖1a)(P＜0.05)。其次是小球藻，在培養(yǎng)的第3天，藻細(xì)胞濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，平均比生長(zhǎng)速率相比低CO2濃度組提高了5.9%(圖1b)。叉鞭金藻和三角褐指藻在培養(yǎng)的第9天，高CO2濃度組的藻細(xì)胞濃度顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05，圖1c、圖1d)。從藻體細(xì)胞濃度來(lái)看，亞心形扁藻和三角褐指藻分別在第11天和第9天達(dá)到峰值，之后增長(zhǎng)減緩；小球藻和叉鞭金藻在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第13天尚處于指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.2 藻體C、N和P元素含量及其比值

不同CO2濃度下4種藻體的C、N、P含量及其比值見(jiàn)表1?？傮w趨勢(shì)是，CO2濃度升高提高了4種藻藻體的 C含量，其中小球藻達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)；高CO2濃度下，4種藻藻細(xì)胞N含量均出現(xiàn)降低趨勢(shì)，其中，僅亞心形扁藻的N含量顯著降低(P＜0.05)，其他3種藻N含量變化不顯著(P＞0.05)；不同藻藻體的P含量變化趨勢(shì)不同，亞心形扁藻和小球藻高CO2濃度組顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)，但叉鞭金藻和三角褐指藻P含量變化不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同CO2濃度下4種藻的生長(zhǎng)曲線和比生長(zhǎng)速率Fig.1 Growth curves and the specific growth rate of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

表1 4種藻在不同CO2濃度下培養(yǎng)7 d后藻體C、N、P含量及其比值Tab.1 C, N and P contents and mole ratios in microalgae cultured with different CO2 concentrations in 7 days

CO2濃度升高使藻體的C/N升高，其中，亞心形扁藻和三角褐指藻 C/N值顯著提高(P＜0.05)，分別從8.16增加至9.89，從10.29增加至13.83；C/P的種間差異較大，亞心形扁藻和小球藻高CO2濃度組顯著高于低 CO2濃度組(P＜0.05)，叉鞭金藻和三角褐指藻與低CO2濃度組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 CO2濃度升高對(duì)4種藻類光合作用參數(shù)的影響

2.3.1 單位細(xì)胞葉綠素a含量的變化 4種藻的單位細(xì)胞葉綠素a含量隨時(shí)間變化情況見(jiàn)圖2。在整個(gè)培養(yǎng)期間(13 d)，除小球藻外，其他3種藻高CO2濃度組的單位細(xì)胞葉綠素a含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。亞心形扁藻和叉鞭金藻分別在培養(yǎng)的第3天和第7天顯著低于低CO2濃度組，其中，亞心形扁藻在實(shí)驗(yàn)后期又逐漸升高，與低 CO2濃度組相比差異達(dá)到顯著程度(P＜0.05)；小球藻單位細(xì)胞葉綠素a含量在第3天顯著提高；而 CO2濃度升高對(duì)三角褐指藻無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

圖2 不同CO2濃度下4種藻單位細(xì)胞葉綠素a含量Fig.2 The chlorophyll a contents of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

2.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 4種藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨時(shí)間變化情況見(jiàn)圖3。亞心形扁藻Fv/Fm的變化范圍為 0.581～0.703(圖3a)，前11 d高CO2濃度組與低CO2濃度組無(wú)顯著差異，之后顯著下降(P＜0.05)；非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)在第 11天，高 CO2濃度組顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)；光化學(xué)淬滅(qP)無(wú)顯著變化(P＞0.05)。CO2濃度升高對(duì)小球藻 NPQ 和qP均無(wú)顯著影響(圖3b)；Fv/Fm在第7天顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其變化范圍在0.552～0.656之間。對(duì)于叉鞭金藻，高CO2濃度條件下的Fv/Fm和qP與低CO2濃度組無(wú)顯著差異；NPQ顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)(圖 3c)。三角褐指藻Fv/Fm變化趨勢(shì)與叉鞭金藻一致，數(shù)值變化范圍在0.482～0.662之間，高CO2濃度組在第 3、5、13天顯著高于低 CO2濃度組(P＜0.05)；高 CO2濃度組 NPQ 在第 11天顯著升高(P＜0.05)；qP先緩慢降低后趨于平穩(wěn)，在第7天和第13天高CO2濃度組qP顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05)(圖 3d)。

2.3.3 指數(shù)生長(zhǎng)期快速光曲線擬合參數(shù) 4種藻的潛在最大相對(duì)電子傳遞效率(rETRmax)、快速光曲線初始斜率(α)見(jiàn)圖4。高CO2濃度條件下，亞心形扁藻和三角褐指藻的 rETRmax顯著提高(P＜0.05)，小球藻、叉鞭金藻無(wú)顯著差異(P＞0.05)；CO2濃度升高對(duì)亞心形扁藻、小球藻、三角褐指藻的快速光曲線初始斜率(α)無(wú)顯著影響(P＞0.05)，叉鞭金藻的α顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05)。

圖3 不同CO2濃度下4種微藻不同熒光參數(shù)的變化Fig.3 Changes of different fluorescence parameters of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

圖4 4種藻快速光曲線擬合參數(shù)rETRmax和α隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.4 Variations of rETRmax and α of the four microalgae with culturing time

3 討論

3.1 不同藻類細(xì)胞數(shù)量對(duì)海水酸化的響應(yīng)

不同種類浮游植物對(duì) CO2濃度升高的響應(yīng)存在較大差異。本研究中，CO2濃度升高顯著促進(jìn)了叉鞭金藻、三角褐指藻、亞心形扁藻和小球藻種群的生長(zhǎng)。毛雪微等(2016)的研究顯示，酸化會(huì)促進(jìn)浮游植物的生長(zhǎng)，CO2濃度升高(1000 μatm CO2)使三角褐指藻實(shí)驗(yàn)組的平均比生長(zhǎng)速率比對(duì)照組高出 33.1%，高于本研究的結(jié)果。導(dǎo)致這種差異的原因可能是酸化程度和光照等實(shí)驗(yàn)條件不同。已有的研究結(jié)果顯示，三角褐指藻的最適光照強(qiáng)度為144 μmol/(m2·s)，在一定范圍內(nèi)，藻體的生長(zhǎng)速率隨光照強(qiáng)度的增加而增加(臧正蓉等,2015)，而毛雪微等(2016)的報(bào)道中光照強(qiáng)度為(139±20) μmol/(m2·s)，本研究光照強(qiáng)度為 80 μmol/m2·s?？梢?jiàn)不同浮游植物對(duì)CO2濃度升高的響應(yīng)程度不同。哪種浮游植物會(huì)在高CO2濃度下成為競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)種，還與自然海域的其他環(huán)境條件有關(guān)。因此，僅憑室內(nèi)的單種培養(yǎng)結(jié)果，不足以預(yù)測(cè)自然海域浮游植物種群及群落結(jié)構(gòu)對(duì)CO2濃度升高的響應(yīng)。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種研究和探測(cè)植物光合生理狀況及各種外界因子對(duì)其細(xì)微影響的新型植物活體測(cè)定技術(shù)，是快速、無(wú)損傷地研究植物光合作用的理想方法。葉綠素?zé)晒鈪?shù)與光合作用中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散和分配等反應(yīng)緊密相連(姜恒等, 2012)。Fv/Fm是藻類生理狀態(tài)的重要指標(biāo)，當(dāng)浮游植物受到光照、溫度、鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子脅迫時(shí)，F(xiàn)v/Fm通常會(huì)顯著降低(梁英等, 2007； 高坤山,2014)。本研究中，4種藻的Fv/Fm值在CO2濃度升高條件下(培養(yǎng)的前7 d內(nèi))并未顯著降低，且小球藻和三角褐指藻分別在第7天和第3天、第5天顯著增加，說(shuō)明高CO2濃度并未造成脅迫，同時(shí)提高了小球藻和三角褐指藻的最大光和效率。NPQ為非光化學(xué)淬滅系數(shù)，反映 PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散的那部分能量，目的是緩解過(guò)剩的激發(fā)能對(duì) PSⅡ反應(yīng)中心的破壞，是一種自我保護(hù)機(jī)制(梁英等,2007)。本研究中，亞心形扁藻高CO2濃度組的NPQ在第3天顯著降低，叉鞭金藻高CO2濃度組NPQ除第5天外均顯著低于低CO2濃度組，類似情況在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)：在高pCO2水平(101.3 Pa)下，三角褐指藻 NPQ與對(duì)照(39.3Pa)相比顯著降低(Wuet al,2010)，這可能是由于當(dāng)前海洋環(huán)境下存在叉鞭金藻的碳源供應(yīng)限制(王東升, 2015)。qP是光化學(xué)淬滅，反映 PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額。三角褐指藻高CO2濃度組qP在第7天、第13天顯著增加，PSⅡ的電子傳遞活性增強(qiáng)，光合活性升高。α表示藻類對(duì)光能的利用效率，CO2濃度升高顯著提高了指數(shù)生長(zhǎng)期叉鞭金藻α值，與徐金濤等(2016)研究的塔瑪亞歷山大藻的結(jié)果不一致。分析原因，可能與藻體的種間差異、實(shí)驗(yàn)條件不同等有關(guān)。徐金濤等(2016)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，光照強(qiáng)度為 120 μmol/(m2·s)，pH 為 8.0±0.1，與本實(shí)驗(yàn)條件略有差異?？梢?jiàn)，不同藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)CO2濃度升高的響應(yīng)不同，其中除了小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒(méi)有顯著差異外，CO2濃度升高引起的酸化環(huán)境對(duì)其他3種藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)均有不同程度的影響，敏感程度各不一致。

浮游植物光合作用的強(qiáng)弱是影響其種群生長(zhǎng)速率的主要因素。色素含量高低與藻細(xì)胞光合作用強(qiáng)弱有直接的關(guān)系，也間接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖(梁英等,2007)，其中葉綠素a是海洋浮游植物中除藍(lán)藻以外均含有的特征色素(徐金濤等, 2016)，因此，CO2濃度升高對(duì)藻體葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉綠素a含量產(chǎn)生的影響，最終表現(xiàn)為對(duì)浮游植物細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。高CO2濃度條件下，亞心形扁藻和小球藻分別通過(guò)增強(qiáng)rETRmax和升高單位細(xì)胞葉綠素a含量來(lái)促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量的增加。同時(shí)，CO2濃度升高加快了叉鞭金藻的電子傳遞速率，增強(qiáng)了對(duì)光能的吸收能力，并提高了三角褐指藻的潛在最大光合作用能力，促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。浮游植物的光合作用是一系列復(fù)雜代謝反應(yīng)的總和，CO2濃度升高對(duì)其光合作用過(guò)程及生長(zhǎng)的具體影響機(jī)制還有待今后進(jìn)一步研究。

3.2 CO2濃度升高引起的海水酸化對(duì)不同藻類質(zhì)量的影響

自然環(huán)境中海洋浮游植物 C、N、P比值趨近于106 ：16 ：1(Redfield, 1934)，但由于浮游植物可有效利用的N、P濃度存在很大差異，加之光強(qiáng)、溫度和CO2濃度等變化，導(dǎo)致很多藻類的 C、N、P比不同于 Redfield 比值(Fuet al, 2007； Finkelet al, 2010)。本研究結(jié)果顯示，CO2濃度的增加提高了亞心形扁藻的C/N、C/P值、小球藻的 C/P值和三角褐指藻的C/N值，藻體中N、P含量相對(duì)減少，偏離了Redfield比值，使其作為食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。藍(lán)細(xì)菌聚球藻(Synechococcus)是海洋浮游植物群落的優(yōu)勢(shì)組分，是全球碳循環(huán)的主要參與者和初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的光合作用、碳循環(huán)及食物鏈中扮演著舉足輕重的角色(馬英等, 2004)。Fu等(2007)對(duì)藍(lán)細(xì)菌聚球藻的研究顯示，在 CO2濃度升高(750×10-6)的條件下，C、N含量、C/P值均升高，與本研究結(jié)果一致。Urabe等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度增加提高了浮游植物C/P值，使其作為食物的質(zhì)量下降，進(jìn)而對(duì)水溞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。在 N、P限制條件下培養(yǎng)的餌料微藻C/N、C/P比值升高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值發(fā)生了變化，使安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)各時(shí)期個(gè)體的N、P含量顯著降低，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和攝食均產(chǎn)生了抑制作用(石琛等, 2011； 何學(xué)佳等,2012)。CO2濃度升高對(duì)浮游植物C、N、P比值的影響會(huì)沿食物鏈向上傳遞，使得植食性動(dòng)物，如浮游動(dòng)物、濾食性貝類等的食物品質(zhì)下降，對(duì)浮游動(dòng)物、濾食性貝類等次級(jí)生產(chǎn)者的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖等產(chǎn)生一系列影響，進(jìn)而影響整個(gè)食物網(wǎng)(Rossollet al, 2012；陳蕾等, 2014)。由于種間異質(zhì)性，不同藻類對(duì) CO2濃度升高的響應(yīng)不同，今后應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)不同種類的研究，并結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等(高坤山, 2011； 陳蕾等,2014)，綜合探討氣候變化對(duì)食物鏈及海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響。