王祎哲, 韓朝婕,卜世勛,韓 旭,周文禮,賈旭穎

(天津農學院水產學院，天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

引 言

小球藻屬(Chlorella)微藻作為目前微藻中應用開發(fā)較多的種類，不僅具有較高的生長速度，還蘊含豐富營養(yǎng)價值，如蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質和類胡蘿卜素等[10]，細胞中所含有的類胡蘿卜素可作為抗氧化劑[11]，在增強免疫系統(tǒng)[12]，預防心血管疾病[13]、白內障[14]等方面具有巨大的潛力。因其豐富的營養(yǎng)成分和醫(yī)療保健作用，小球藻被認定為是一種及其重要的微藻資源[15]。除此之外，在魚類育苗、養(yǎng)殖生產中，小球藻作為水體中重要的生物組分部分，既可以在工廠化人工育苗技術中作為最常用的基礎生物餌料[16-18]，又可以吸收水體中的氨氮等其他有害物質[19]。

賁月等[20]的研究表明：選取海藻酸鈉對銅綠微囊藻有顯著的固定效果，對藻類的生長有促進效果。具備較好的傳質能、機械強度、避免生物分解的能力，且對生物無害的優(yōu)點，是較好的固定化細胞的材料。本文選取海藻酸鈉作為固定化載體，研究固定化與液體懸浮態(tài)兩種培養(yǎng)方式小球藻對生長、光合色素含量及葉綠素熒光參數的影響，以期為此后的微藻培養(yǎng)技術找到一種高效、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 微藻及培養(yǎng)

小球藻由天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室提供，基礎培養(yǎng)基為海水配制的經120℃ 條件下滅菌20 min的f/2培養(yǎng)基。取對數生長期生長良好的小球藻按照藻液∶培養(yǎng)基=1∶1的比例在超凈工作臺內接種，在恒定培養(yǎng)箱內進行靜置培養(yǎng)，設定培養(yǎng)箱溫度為25 ℃，光照強度為50 μmol/(m2·s)，光照周期為12 L∶12 D，每天定時至少搖動3次藻液防止貼壁或沉淀。

1.2 試驗方法

1.2.1 小球藻的固定化培養(yǎng)

將培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基中的生長狀況良好的小球藻，5000 r/min離心10 min，把上清液棄除后，將小球藻混合于4% 的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，利用10 mL注射器在距離預冷后的CaCl2溶液水面20 cm處滴入，形成小球狀，靜置1 h后，滅菌蒸餾水洗滌多次備用，放入配制好的f/2培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.1。

1.2.2 小球藻膠球解固定

從培養(yǎng)液中取出一定數量的膠體小球，滴加一定量的3%的檸檬酸鈉溶液，靜置至膠球完全溶解。

1.3 測定方法

1.3.1 細胞密度測定

采用血球計數板法對藻細胞密度進行測定。

1.3.2 色素含量測定

參考乙醇法對藻類進行葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量測定。

取樣品5 mL經5000 r/min離心10 min去掉上清液，加入5 mL 95%乙醇溶液后于4℃冷藏24 h后，經5000 r/min離心10 min取上清，測定各波長下吸光值。

Ca(mg/L)=13.95A665-6.88A649

(1)

Cb(mg/L)=24.96A649-7.32A665

(2)

Cc(mg/L)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

(3)

式中:Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cc為類胡蘿卜素的總濃度；A665、A649和A470分別為葉綠體色素提取液在波長665 nm、649 nm和470 nm下的吸光度。

1.3.3 葉綠素熒光參數的測定

利用葉綠素熒光儀對葉綠素熒光各個參數進行測定。測定前，將1 cm樣品放置于比色皿中暗適應15 min，啟動葉綠素熒光儀測定初始熒光產量(F0)，飽和脈沖后再測定小球藻的最大熒光產量(Fm)，以此計算出最大光能轉化效率(Fv/Fm，F(xiàn)v為可變熒光產量)。測定的葉綠素熒光參數有F0、Fm、F0'、Fm'、Fs等，并根據熒光儀所提供的公式，計算出最大光能轉化效率(Fv/Fm)、實際光能轉化效率(ΦPSⅡ)和量子效率(yield)的熒光參數。具體公式如下：

最大光能轉化效率Fv/Fm=( Fm-F0)/Fm

(4)

實際光能轉化效率ΦPSⅡ=( Fm'-Fs ) /Fm'

(5)

量子效率yield= Fv'/Fm'=( Fm'-F0' ) /Fm'

(6)

1.4 數據分析

所有結果用“均值±標準差(mean±S.D.)”表示，使用SPSS19.0進行單因素方差分析(One-way test)、T檢驗(T-test)和Duncan多重比較分析，并用Sigma Plot14.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 固定化培養(yǎng)對小球藻細胞密度的影響

固定化培養(yǎng)對小球藻細胞密度的影響如圖1所示，試驗期間，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩種培養(yǎng)方式小球藻細胞密度均顯著升高(P<0.05)。試驗初期(2—4 d)固定化培養(yǎng)小球藻細胞密度高于液體懸浮態(tài)小球藻，但二者之間差異不顯著(P>0.05)，試驗中后期(6—10 d)，固定化培養(yǎng)小球藻細胞密度增長明顯，試驗結束時其細胞密度達到2.641×106cells/mL，是懸浮態(tài)的1.27倍，顯著高于懸浮態(tài)小球藻細胞密度(P<0.05)。

圖1 固定化培養(yǎng)對小球藻藻細胞密度的影響

2.2 固定化培養(yǎng)對小球藻光合色素含量的影響

固定化培養(yǎng)對小球藻光合色素含量的影響如圖2所示，試驗第2天，兩種培養(yǎng)方式小球藻之間的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均無顯著差異(P>0.05)，從第4天開始固定化培養(yǎng)小球藻三種光合色素含量均出現(xiàn)大幅度增長，在試驗的 4—10 d，固定化培養(yǎng)小球藻三種光合色素含量均顯著高于液體懸浮態(tài)小球藻(P<0.05)。試驗結束時，固定化培養(yǎng)小球藻葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別達到液體懸浮態(tài)小球藻的3.79倍3.54倍和3.01倍。在試驗期間，隨著培養(yǎng)時間的延長，固定化培養(yǎng)小球藻三種色素含量始終處于上升趨勢，而液體懸浮態(tài)小球藻各色素含量均在第8天達到峰值，而在第10天開始出現(xiàn)下降。

圖2 固定化培養(yǎng)對小球藻光合色素含量的影響

2.3 固定化培養(yǎng)對小球藻葉綠素熒光參數的影響

由圖3可見，試驗開始后，固定化培養(yǎng)和懸浮態(tài)培養(yǎng)小球藻的Fv/Fm均顯著升高，在試驗的2—10 d，懸浮態(tài)小球藻Fv/Fm基本穩(wěn)定，而固定化培養(yǎng)小球藻Fv/Fm在試驗2 d后仍持續(xù)升高，在4—10 d保持穩(wěn)定。試驗初期(第2天)，固定化小球藻的Fv/Fm顯著低于液體懸浮態(tài)小球藻，而在試驗后的4—10 d，固定化小球藻的Fv/Fm則顯著高于懸浮態(tài)培養(yǎng)小球藻(P<0.05)。試驗開始后，兩種培養(yǎng)方式小球藻ΦPSⅡ均呈上升趨勢，但是在2—8 d，液體懸浮態(tài)小球的ΦPSⅡ升高趨勢不顯著(P>0.05)，而固定化小球藻在試驗的4—10 d顯著升高，呈顯著的上升趨勢(P<0.05)。試驗的2—4 d兩種培養(yǎng)模式小球藻ΦPSⅡ 無顯著性差異(P>0.05)，從試驗第6天起固定化培養(yǎng)小球藻實際光能轉化效率顯著始終高于懸浮態(tài)(P<0.05)。試驗初期，固定化與液體懸浮態(tài)小球藻的量子效率在顯著升高，但固定化培養(yǎng)小球藻量子效率的升高幅度遠大于液體懸浮態(tài)小球藻，試驗4—10 d，固定化培養(yǎng)小球藻量子效率顯著高于液體懸浮態(tài)小球藻(P<0.05)。

圖3 固定化培養(yǎng)對小球藻葉綠素熒光參數的影響

3 討論

3.1 固定化培養(yǎng)對小球藻細胞密度的影響

細胞密度可以直觀地反映藻類的生長情況，固定化培養(yǎng)使小球藻的生存環(huán)境和自身的適應能力均發(fā)生了不同程度的改變[8]。本試驗結果表明，固定化細胞在培養(yǎng)前期生長速率較慢，隨后開始迅速生長，最終生物量顯著高于液體懸浮態(tài)，可見，固定化培養(yǎng)更有利于纖細裸藻的生長，但固定化培養(yǎng)初期細胞生長較為緩慢，主要是由于固定化膠球制作這一系列過程對細胞生長環(huán)境有一定程度的改變，以及試驗初期營養(yǎng)物質和光線進入膠珠受到一定水平的影響，因此妨礙其生長的緣故[8]，可見，試驗初期藻細胞需要一定時間來適應生長環(huán)境的改變。試驗后期，固定化培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的生長趨勢，說明固定化小球藻的生長情況優(yōu)于液體懸浮態(tài)，已有研究證明，通過對藻的數量、形態(tài)以及對燃料降解能力比較的研究，經優(yōu)化固定條件后培養(yǎng)的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)以上指標均優(yōu)于液體懸浮態(tài)，證明固定化后培養(yǎng)提高了藻的生長狀態(tài)與合成代謝活性[21]。固定化小球藻的生長性能有所提高，可能是固定化培養(yǎng)條件不僅提高了小球藻藻細胞的合成代謝，并且在一定程度上降低了藻細胞的分解代謝，能較長時間的保持藻細胞的活性，延遲藻細胞的衰老[22]。

3.2 固定化培養(yǎng)對小球藻光合色素含量的影響

藻類進行光合作用時是由色素蛋白復合體進行光能捕獲完成的，藻體內常見的色素可依據在光合作用過程中的作用分為捕光色素和光保護色素，其中以葉綠素a、葉綠素b為代表的捕光色素可將吸收的光能有效地傳遞到相關的反應中心轉變?yōu)榛瘜W能，而類胡蘿卜素作為光保護色素將剩余能量吸收，避免膜體受傷，從而達到光保護作用[23]。藻體內光合色素的含量和光合作用有密切的關系，因此，可通過光合色素含量的多少來判斷藻類的生理狀態(tài)[24]。

固定化培養(yǎng)對小球藻的葉綠素a、b、類胡蘿卜素含量都有一定程度上的增加，第4天起，固定化培養(yǎng)各色素含量均高于液體懸浮態(tài)培養(yǎng)。由此發(fā)現(xiàn)，固定化培養(yǎng)對小球藻的光合色素含量的增加具有促進作用，且液體懸浮態(tài)第10天時各色素出現(xiàn)下降，分析原因可能是培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質不足以滿足藻細胞新陳代謝的需要，生長緩慢，葉綠素的合成減少，含量出現(xiàn)下降[25]，而固定化培養(yǎng)延緩了小球藻色素含量下降的時間，因此，固定化培養(yǎng)的小球藻在色素含量以及色素增長時間兩方面均要優(yōu)于液體懸浮態(tài)小球藻。Bailliez[26]等人也報道了固定化培養(yǎng)后的布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)葉綠素含量較高，推測是因固定化后藻細胞光合作用增強，且物質能量消耗也有所降低所致，也就是固定化培養(yǎng)的小球藻能量的合成大于消耗，從而能量得以高效積累[27]。對于固定化培養(yǎng)后的銅綠微囊藻(Nannochloropsisoculata)也得出同樣的結論，固定化藻細胞的合成代謝能力得到了提高[28]，同時也說明了固定化藻類在色素積累方面確實要優(yōu)于液體懸浮態(tài)微藻；富烴葡萄藻(Botryococcusprotuberans)經藻酸鹽包埋后，在穩(wěn)定期產生的葉綠素、類胡蘿卜素及其干質量以及光合效率與游離細胞相比都有明顯增加[29]。以上與本試驗固定化培養(yǎng)對小球藻生長情況及色素含量具有優(yōu)勢影響相一致，固定化培養(yǎng)提高了小球藻的合成代謝，光合色素含量增加，且色素下降時間得到了延緩。

3.3 固定化培養(yǎng)對小球藻葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光作為光合作用的有效探針，能夠客觀地反映植物光合能力的強弱和光合器官PSⅡ活性[30]。本試驗結果表明，僅在培養(yǎng)的前2天，固定化小球藻的Fv/Fm低于液體懸浮態(tài)小球藻，而在培養(yǎng)的中后期，其結果與前期恰好相反，固定化小球藻的Fv/Fm值更高。Fv/Fm反映了光反應中心PSⅡ的最大量子產量[31]，此值明顯變低說明植物正處于環(huán)境脅迫中[32]，說明試驗初期固定化藻細胞處于環(huán)境脅迫中，光合活性受到抑制[33]，但在試驗后期，固定化小球藻始終處于生長階段，且通過Fv/Fm升高體現(xiàn)出固定化小球藻有較好的生長狀態(tài)與光合活性。

本研究表明，固定化培養(yǎng)對小球藻葉綠素熒光參數有顯著影響。在固定化與液體懸浮態(tài)這兩種方式培養(yǎng)中，固定化培養(yǎng)的小球藻ΦPSⅡ、yield參數均有明顯上升趨勢。即固定化培養(yǎng)的光合特性和生長情況均優(yōu)于液體懸浮態(tài)，更適宜小球藻生長，提高其光合效率，這與對小球藻(ChlorellasorokinianaGXNN 01)固定化后，其生物量、生長率和光合活性等方面都略優(yōu)游離態(tài)小球藻這一結果相似[34]，雖由于上述所提及到的小球藻因改變自身狀態(tài)會出現(xiàn)生長緩慢期，但從整體來看，固定化培養(yǎng)的小球藻生長狀態(tài)、光合特性均優(yōu)于液態(tài)懸浮狀態(tài)的小球藻。這也說明固定化培養(yǎng)小球藻較比液體懸浮狀態(tài)小球藻有促進其生長的作用。

4 結論

綜上所述，固定化培養(yǎng)對小球藻生長及生理特性產生了顯著的影響，小球藻固定化培養(yǎng)在細胞密度、光合色素含量及光合活性方面均優(yōu)于液體懸浮態(tài)培養(yǎng)。