陳汝詩 許譯方 譚啟杏 莫?dú)J國 覃慶洪

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，南寧530021)

乳腺癌發(fā)病率位居女性腫瘤第一位，其死亡人數(shù)在全球范圍內(nèi)占惡性腫瘤死亡人數(shù)的15%[1]。目前，中國的乳腺癌發(fā)病率日漸增加，遠(yuǎn)高于世界年均0.5%的增長率，嚴(yán)重威脅著女性健康[2]。探索影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的因素并對其進(jìn)行干預(yù)，是乳腺癌研究的重要領(lǐng)域之一。

研究表明，代謝異常是腫瘤發(fā)生過程中的一個核心問題，能量代謝的改變是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一[3-5]。P53是調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵因子，而細(xì)胞色素C氧化合成酶2(Synthesis of cytochrome C oxidase 2,SCO2)是第一個被確定的 p53 轉(zhuǎn)錄調(diào)控能量代謝的靶基因，其功能是將銅原子轉(zhuǎn)運(yùn)至COX，促進(jìn)氧化磷酸化的作用[6]。p53在調(diào)控乳腺癌及其他腫瘤的能量代謝及凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，在乳腺癌細(xì)胞中，p53可以通過調(diào)節(jié)SCO2的表達(dá)誘導(dǎo)糖酵解和調(diào)節(jié)凋亡調(diào)節(jié)因子的合成來實(shí)現(xiàn)氧化磷酸化向糖酵解的轉(zhuǎn)變，從而參與能量代謝[7]。但SCO2對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，本文利用慢病毒干擾 SCO2基因，觀察人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長的變化，研究SCO2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步探索其潛在的機(jī)制。為進(jìn)一步研究SCO2基因在乳腺癌中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231均購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于以色列Bioind公司;Trizol Reagent 購于Ambition公司;各引物設(shè)計(jì)、合成及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購于TaKaRa公司;鼠抗人SCO2多克隆抗體β-Actin抗體均購于美國 Abcam 公司；兔抗人caspase3抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,羊抗鼠IgG均購于美國CST公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體購于萬類生物科技公司；重組慢病毒(LV-shRNA-SCO2)購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；Annein V PE apoptosis Detection試劑盒購于BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A用含10% 胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素的RPMI1640液體培養(yǎng)體系培養(yǎng)，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及MDA-MB-231用含10% 胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)體系培養(yǎng)，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2慢病毒感染MCF-7細(xì)胞 將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞按2×103個/孔接種于 96 孔板中，用含10% 胎牛血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到約40%時，加入重組慢病毒LV-shRNA-SCO2或陰性對照病毒LV-shRNA-NC感染MCF-7細(xì)胞，72 h后，用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染成功的實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞命名為MCF-7/shRNA-SCO2，陰性對照組為MCF-7/shRNA-NC。以下各種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA的表達(dá) 用Trizol提取細(xì)胞中總的RNA，并檢測其純度，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果用 2-ΔΔCT法計(jì)算 mRNA 相對表達(dá)量。GAPDH的上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。SCO2的上游引物：5′-AGCAGCAAAAGCGAACAGAAG-3′，下游引物:5′-GGCAGTGAGTGAAGCCAAAG-3′。

1.2.4Western blot檢測蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞裂解蛋白后上樣，以60 V恒壓電泳30 min后再以100 V恒壓電泳。冰浴條件下，100 mA恒流轉(zhuǎn)膜 90 min，PVDF 膜于5%脫脂奶粉中封閉2 h，搖床上4℃孵育一抗(SCO20.5 μg/ml、β-actin 1∶1 000、Cleaved-caspase3 1∶1 000、Bax 1∶1 000 、Bcl-2 1∶500)過夜。TBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的二抗(羊抗鼠1∶1 000、羊抗兔1∶1 000)室溫孵育1 h,TBST漂洗3次，每次10 min。ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5生長曲線的繪制 將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化制備成單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照約2 000個細(xì)胞每孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 d后取出，加入10 μl/孔CCK8試劑后繼續(xù)孵育2 h，于酶標(biāo)儀 450 nm波長下檢測每孔吸光度值。1.2.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別取各組細(xì)胞以200個/孔密度接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d，用PBS小心洗滌細(xì)胞3次，甲醇固定20 min,Giemsa染液染色20 min,流水緩慢洗去染色液。鏡下計(jì)數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=(細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 感染96 h后，胰酶消化各組細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用1XPBS重懸洗滌細(xì)胞一次，2 000 r/min 離心5 min；加入300 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞；加入5 μl 7-AAD和5 μl PE Annexin V，室溫避光孵育30 min；上機(jī)前，補(bǔ)加400 μl的1×Binding Buffer；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1SCO2mRNA及蛋白在MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá) qRT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中SCO2mRNA及SCO2蛋白的相對表達(dá)水平均低于人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明 SCO2mRNA和SCO2蛋白在人乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)水平明顯低于人正常乳腺上皮細(xì)胞,同時，SCO2mRNA和SCO2蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株的相對表達(dá)水平明顯低于MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1，圖1、2。

2.2重組慢病毒轉(zhuǎn)染乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞 慢病毒轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞96 h后熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)，陰性對照組MCF-7/shRNA-NC和SCO2基因轉(zhuǎn)染組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞均可見到綠色熒光，且?guī)в芯G色熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的90%左右，表明轉(zhuǎn)染成功。見圖3。

表1MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中SCO2mRNA和SCO2蛋白的相對表達(dá)水平

Tab.1RelativeexpressionlevelsofSCO2mRNAandSCO2proteininMCF-10A,MCF-7andMDA-MB-231cells

GroupsmRNA ProteinMCF-10A1.000±0.0001.702±0.041MCF-70.583±0.0271)1.524±0.0201)MDA-MB-2310.143±0.0332)1.435±0.1902)

Note：1)P<0.05 vs MCF-10A group and MDA-MB-231 group；2)P<0.05 vs MCF-10A group and MCF-7 group.

圖1 MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中SCO2 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 SCO2 mRNA expression levels in MCF-10A,MCF-7 and MDA-MB-231 cellsNote: Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3沉默SCO2基因后各組細(xì)胞中SCO2mRNA及蛋白的表達(dá) qRT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示， 實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2的SCO2mRNA和SCO2蛋白的相對表達(dá)量低于空白對照組MCF-7和陰性對照組MCF-7/shRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2，圖4、5。

2.4SCO2基因表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響 CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞在第1、2、3、4、5天各時間點(diǎn)吸光度值均高于相應(yīng)時間點(diǎn)的陰性對照組MCF-7/shRNA-NC細(xì)胞和空白對照組MCF-7細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。說明沉默SCO2基因可以增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的增殖能力。

圖2 MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中SCO2蛋白的表達(dá)水平Fig.2 SCO2 protein expression levels in MCF-10A,MCF-7 and MDA-MB-231 cells

圖3 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染SCO2慢病毒后的乳腺癌MCF-7細(xì)胞(×100)Fig.3 Fluorescence imagines of MCF-7 cells when infection with lentivirus(×100)Note: A.Negative group under bright view；B.Negative group under fluorescence view；C.shRNA-SCO2 group under bright view；D.shRNA-SCO2 group under fluorescence view.

2.5SCO2基因表達(dá)對MCF-7細(xì)胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞的克隆形成率高于陰性對照組MCF-7/shRNA-NC細(xì)胞和空白對照組MCF-7細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。說明沉默SCO2基因促進(jìn)MCF-7細(xì)胞克隆形成。

2.6SCO2基因表達(dá)對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞的凋亡率低于陰性對照組MCF-7/shRNA-NC細(xì)胞和空白對照組MCF-7細(xì)胞， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。說明沉默SCO2基因抑制MCF-7細(xì)胞的凋亡。

表2沉默SCO2基因前后MCF-7細(xì)胞中SCO2mRNA和SCO2蛋白的表達(dá)水平

Tab.2RelativeexpressionlevelsofSCO2mRNAandSCO2proteinincellsinfectionwithlentivirus

GroupsmRNAProteinControl1.000±0.0000.634±0.044Negative1.035±0.1990.662±0.031shRNA-SCO20.232±0.2331)2)0.374±0.2251)2)

Note：1)P<0.05,2)P<0.05 vs negative group.

圖4 沉默SCO2基因前后MCF-7細(xì)胞中SCO2 mRNA的表達(dá)水平Fig.4 SCO2 mRNA expression levels in cells infection with lentivirusNote: Compared with control and negative group,**.P<0.01.

圖5 沉默SCO2基因前后MCF-7細(xì)胞中SCO2蛋白的表達(dá)水平Fig.5 SCO2 protein expression levels in cells infection with lentivirus

圖6 沉默SCO2基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖能力的影響Fig.6 Effect of silencing SCO2 gene on proliferation of MCF-7 cells

圖7 沉默SCO2基因?qū)CF-7細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.7 Effect of silencing SCO2 gene on clone formation of MCF-7 cellsNote: Compared with control group and negative group,*.P<0.05.

圖8 沉默SCO2基因?qū)CF-7細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of silencing SCO2 gene on apoptosis of MCF-7 cellsNote: A.Control;B.Negative;C.shRNA-SCO2;D.The apoptosis rate in each group.Compared with control group and negative group,*.P<0.05.

圖9 抑制SCO2的表達(dá)對細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of silencing SCO2 gene on expression of protein levels of Bax,Bcl-2,Pro-caspase3 and Cleaved-caspase3 in cellsNote: Compared with control group and negative group,*.P<0.05.

2.7SCO2基因?qū)CF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞中Bax、Cleaved caspase3蛋白的相對表達(dá)量低于空白對照組MCF-7細(xì)胞和陰性對照組MCF-7/shRNA-NC細(xì)胞中的相對表達(dá)量，而實(shí)驗(yàn)組MCF-7/shRNA-SCO2細(xì)胞中Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量高于空白對照組MCF-7細(xì)胞和陰性對照組MCF-7/shRNA-NC細(xì)胞中的相對表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。

3 討論

p53基因在調(diào)節(jié)腫瘤能量代謝過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]，目前認(rèn)為，p53主要通過調(diào)控下游基因TIGAR(TP53 induced glycolysis and apoptosis regulator)和SCO2的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞有氧呼吸及糖酵解之間的平衡[9]。而SCO2是第一個被確認(rèn)的p53基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控能量代謝的靶基因[10]。p53基因可能通過SCO2影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Won等[11]發(fā)現(xiàn)SCO2基因低表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后比較差。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞系中SCO2mRNA和蛋白表達(dá)水平差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞，而在侵襲能力較強(qiáng)的MDA-MB-231中的表達(dá)又顯著低于MCF-7細(xì)胞。由此可見，SCO2水平可能與乳腺癌的侵襲能力相關(guān)，SCO2低表達(dá)可能是造成乳腺癌預(yù)后不良的原因之一，探索SCO2參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可能對乳腺癌防治起到重要作用，SCO2基因可能具有作為乳腺癌基因靶向治療靶點(diǎn)的潛力。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SCO2表達(dá)水平的下降，乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明SCO2基因的表達(dá)與乳腺癌的增殖及凋亡有關(guān)。降低其表達(dá)水平后可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，并抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，提示我們SCO2基因可能通過參與凋亡過程在乳腺癌發(fā)展中起作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序化死亡過程，其中涉及多種凋亡調(diào)控因子，例如Bcl-2蛋白質(zhì)家族,包括抑制凋亡的蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白 Bax等關(guān)鍵蛋白[12,13],研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白間的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵,比例的降低提示凋亡被抑制[14]。大量研究顯示[15]，caspase 家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用。其中,caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，caspase-3被激活后最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]，本研究發(fā)現(xiàn)，沉默SCO2基因后下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Bax和Cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)量,同時上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)量，提示SCO2基因可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控caspase3活化水平，從而誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生凋亡，干擾乳腺癌發(fā)展。

綜上所述，SCO2基因沉默可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，SCO2的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)及凋亡至關(guān)重要。但是乳腺癌的發(fā)展與體內(nèi)環(huán)境密切相關(guān)，體外研究結(jié)果具有局限性，通過體內(nèi)研究進(jìn)一步探索SCO2在乳腺癌發(fā)展中的作用,將進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索。