林 駿 山 云 劉 謙 王曉煒 王洪濤 劉 堯

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心，深圳518057)

1975年德國(guó)科學(xué)家Kohler和英國(guó)科學(xué)家Milstein將能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與能永生的髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，成功建立了表達(dá)單克隆抗體技術(shù)[1]。單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)是借助PCR方法的發(fā)展和抗體生產(chǎn)的成熟使得通過(guò)單細(xì)胞RT-PCR，在體外進(jìn)行克隆和表達(dá)，使單個(gè)人類B細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體成為可能。與傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)相比，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)需要的細(xì)胞量少，基因多樣性好、效率高、可全人源、同時(shí)保留了自然的重鏈和輕鏈[2]。

CRP(C-reactive protein)是一種非特異性炎癥標(biāo)志物，正常的人血清濃度在5～10 mg/L之間，晚期妊娠婦女、輕度炎癥和病毒感染(10～40 mg/L)、活躍炎癥、細(xì)菌感染(40～200 mg/L)、嚴(yán)重細(xì)菌感染和燒傷(>200 mg/L)。CRP在炎癥開(kāi)始后2 h內(nèi)上升，48 h內(nèi)達(dá)到峰值，半衰期為18 h，CRP在臨床上常作為急性炎癥和感染的診斷指標(biāo)[3]。目前的研究證明CRP不僅作為炎癥預(yù)示因子，其本身也作為一種促炎因子與動(dòng)脈粥樣硬化等疾病息息相關(guān)，人血漿內(nèi)CRP濃度在1～10 mg/L濃度的高低與心血管疾病密切相關(guān)[4-6]。高敏CRP診斷(high-sensitivity CRP，hs-CRP)檢測(cè)靈敏度高，能準(zhǔn)確定量 0.1～10 mg/L濃度范圍內(nèi)的 CRP含量，但是hs-CRP 診斷試劑盒和主要單抗原料依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴不利推廣[7]。本研究的目的是利用單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)結(jié)合Exip 293真核表達(dá)系統(tǒng)制備高靈敏CRP單克隆抗體，并經(jīng)過(guò)試驗(yàn)獲得兩個(gè)能檢測(cè)人CRP的單克隆抗體，初步建立并評(píng)估了雙抗體夾心ELISA生物素-親和素檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 載體pcDNA3.1(+)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，Expi 293真核表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自Thermo Fisher公司；菌株E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、Ni-NTA親和層析柱、Protein A純化層析柱、Western blot試劑、快速銀染試劑盒、生物素、HRP-鏈霉親和素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；ELISA板購(gòu)自美國(guó)康寧公司； TMB單組分顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CRP重組蛋白的制備與鑒定 對(duì)GenBank提供的CRP 全長(zhǎng)基因編碼序列進(jìn)行分析，在編碼序列兩端加上酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ及保護(hù)堿基進(jìn)行全基因合成。雙酶切載體 pcDNA3.1(+)后與同樣酶切過(guò)的 CRP 基因片段連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒并送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的CRP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)Expi 293真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。

1.2.2免疫小鼠 用重組CRP蛋白免疫小鼠，免疫四周后初步檢測(cè)抗體滴度，免疫6周后處死小鼠，取出小鼠脾臟，用剪刀剪碎脾臟組織并用胰蛋白酶將脾臟組織消化分離成單細(xì)胞。

1.2.3分離單個(gè)B細(xì)胞 利用不同熒光標(biāo)記抗體anti-CD3、anti-CD8、anti-F4/80,anti-CD20對(duì)不同的淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，同時(shí)加入抗原蛋白CRP制備的熒光標(biāo)記探針對(duì)目標(biāo)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色，借助流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)FACS(Fluorescence activated Cell Sorting)從中分離出能表達(dá)特異性抗體的單個(gè)B細(xì)胞(CD3-/CD8-/F4/80-/CD20+/IgM-/IgD-/IgG+/Probe+)。

1.2.4擴(kuò)增編碼序列 提取單個(gè)B細(xì)胞的mRNA，進(jìn)行RT-PCR合成cDNA，以cDNA為模板分別擴(kuò)增出編碼抗體輕重鏈的核酸序列，將編碼序列酶切插入pcDNA3.1(+)載體中構(gòu)建出編碼特定抗體輕重鏈的重組質(zhì)粒。

1.2.5真核表達(dá)系統(tǒng)制備抗體 將同一抗體的輕鏈質(zhì)粒與重鏈質(zhì)粒按1∶1 質(zhì)量比混合后轉(zhuǎn)染進(jìn)Expi 293細(xì)胞中進(jìn)行單克隆抗體輕重鏈的表達(dá)和組裝，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并用Protein A親和純化出單克隆抗體。SDS-PAGE電泳后用銀染方法檢測(cè)其純度。

1.2.6ELISA生物素-親和素檢測(cè)體系的初步建立

1.2.6.1篩選特異性抗體 本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA法將重組CRP蛋白和CRP(+)血清1，CRP(+)血清2分別包被在酶聯(lián)免疫微孔板上，濃度為1 μg/ml，篩選出能識(shí)別重組CRP蛋白及血清中CRP成分的單克隆抗體，并進(jìn)一步檢測(cè)已篩選的抗體對(duì)CRP識(shí)別的特異性。

1.2.6.2建立檢測(cè)方法體系 將純化后的特異性單抗作為捕獲抗體稀釋成不同濃度，在4℃條件下過(guò)夜，包被在酶聯(lián)免疫微孔板上，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)制備的另一特異性單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記，進(jìn)行不同比例稀釋，通過(guò)棋盤滴定法確定配對(duì)抗體的最適工作濃度，見(jiàn)表1。

1.2.7ELISA體系性能的評(píng)估

1.2.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析范圍測(cè)試 將質(zhì)量濃度為1 000 ng/ml的CRP重組蛋白作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS倍比稀釋成500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 ng/ml，用所建方法進(jìn)行測(cè)定，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A450 nm為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.2精密度分析 用PBS分別將CRP重組蛋白分別稀釋成150 ng/ml和100 ng/ml作為質(zhì)控樣品，用所建方法分4個(gè)批次分別測(cè)定上述樣品，每批次設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，分別計(jì)算批內(nèi)精密度和批間精密度。

表1棋盤滴定確定工作濃度

Tab.1Optimizationofworkingconcentration

Dilution of biotin-labeled antibodyConcentration of capture antibody10 μg/mlN WP SP5 μg/mlN WP SP1∶2 0000.0440.6521.8840.0460.6781.8501∶3 0000.0100.3691.1320.0220.3841.0321∶40000.0010.2000.6710.0030.2070.5771∶6 0000.0040.1070.3040.0040.0920.249

1.2.7.3回收實(shí)驗(yàn) 用胎牛血清作為基質(zhì)液，將CRP重組蛋白的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成質(zhì)量濃度為1 250、1 000、625、500 ng/ml，按以下方法配置實(shí)驗(yàn)樣品：①基質(zhì)液0.9 ml+PBS 0.1 ml；②分析樣品1：基質(zhì)液0.9 ml+1 250 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml；③分析樣品2：基質(zhì)液0.9 ml+1 000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml；④分析樣品3：基質(zhì)液0.9 ml+625 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml；⑤分析樣品4：基質(zhì)液0.9 ml+500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml。用所建方法測(cè)定上述樣品，每份樣品設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，取平均值后計(jì)算回收率(回收率=檢測(cè)值/實(shí)際值×100%)。

1.2.7.4與臨床樣品的比較 用ELISA檢測(cè)體系分別對(duì)48例臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以ELISA檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，臨床血清標(biāo)本值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1重組CRP蛋白的表達(dá)與鑒定 將構(gòu)建好的含CRP重組DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)Expi 293細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)，由于CRP的重組DNA在N端融合表達(dá)了一個(gè)6×His-tag的氨基酸序列，采用常規(guī)的Ni離子親和層析柱進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳的銀染結(jié)果顯示重組CRP蛋白的純度較高(圖1)。

2.2單克隆抗體的制備和鑒定 重組CRP蛋白免疫小鼠后，篩選分離后獲得4對(duì)抗體輕重鏈基因，表達(dá)純化后SDS-PAGE電泳膠銀染后可見(jiàn)清晰的輕，重鏈條帶，且純度較高(圖2)。分別用重組CRP蛋白，CRP(+)血清1，CRP(+)血清2對(duì)純化后的4個(gè)抗體進(jìn)行篩選，最終獲得2個(gè)能夠特異性免疫CRP蛋白的單克隆抗體20#，22#(圖3A)。分別以重組CRP、CRP+FBS、重組PCT、FBS作為檢測(cè)原檢測(cè)這2個(gè)抗體的特異性，最終，間接ELISA法結(jié)果顯示20#，22#這兩個(gè)抗體對(duì)CRP重組蛋白都具有良好的特異性，并且與無(wú)關(guān)蛋白PCT及FBS均不反應(yīng)(圖3B)。

2.3ELISA體系初步建立

2.3.1實(shí)驗(yàn)條件的初步優(yōu)化 將抗體22#作為捕獲抗體包被在酶聯(lián)免疫微孔板上，濃度分別為10、5、1 μg/ml，生物素標(biāo)記的抗體20#作為檢測(cè)抗體用PBS按比例分別稀釋為1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶6 000，以強(qiáng)陽(yáng)性O(shè)D值在1.0左右，陰性O(shè)D值<0.1為最適工作濃度。最終確定最佳的工作條件為：包被抗體5 μg/ml，檢測(cè)抗體稀釋度為1∶3 000。

2.3.2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將質(zhì)量濃度為1 000 ng/ml的CRP重組蛋白作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS倍比稀釋，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A450 nm為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸分析結(jié)果顯示CRP濃度介于15～250 ng/ml之間有較好的檢測(cè)線性(y=0.003x-0.035 8，R2=0.997 4)(圖4)。

圖1 純化后重組CRP蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE of purified recombinant CRP

圖2 純化后抗體的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE of purified antibodyNote: H.Heavy chain of antibody；L.Light chain of antibody.

圖3 單克隆抗體特異性檢測(cè)Fig.3 Specific identification of monoclonal antibodyNote: A.Specific identification of different monoclonal antibody by ELISA；B.Specific identification of different protein;n=3，P<0.000 1.

表2精密度分析

Tab.2Imprecisionofintra-assayandextra-assay

Standard ofCRP (ng/ml)Intra-assay precisionx±s(ng/ml)cv(%)Inter-assay precisionx±s(ng/ml)cv(%)10099.00±6.706.7097.63±8.328.52150153.03±14.349.37145.65±13.259.10

表3回收率分析

Tab.3RecoveryassayofCRP

ExpectedCRP(ng/ml)ObservedCRP(ng/ml)RecoveryAveragerecovery50 47.88±0.02495.82% 98.03% 62.5 60.18±0.016 96.35% 100 103.71±0.13103.37% 125 12.65±0.017 96.58%

圖4 CRP 的ELISA檢測(cè)體系線性范圍分析Fig.4 Linear range of ELISA system for CRP

2.3.4精密度 本研究使用精密度實(shí)驗(yàn)確定CRP檢測(cè)的可重復(fù)性，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)CV(變異系數(shù)CV=標(biāo)準(zhǔn)方差SD/平均值Mean×100%)為6.7%～9.37%，小于標(biāo)準(zhǔn)值10%，批間變異系數(shù)為8.52%～9.10%，小于標(biāo)準(zhǔn)值15%，說(shuō)明本法檢測(cè)CRP的精密度良好(表2)。

2.3.5回收率 回收率實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的CRP檢測(cè)的回收率介于95%～103%之間，平均回收率為98%，說(shuō)明本法對(duì)CRP檢測(cè)具有較好的準(zhǔn)確性(表3)。

2.3.6與臨床樣品檢測(cè)值的比較分析 同時(shí)對(duì)48例新鮮臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比臨床檢測(cè)數(shù)值，檢測(cè)結(jié)果行線性回歸分析(y=0.950 7x+0.956 1，R2=0.976 1)，兩者檢測(cè)結(jié)果有良好的相關(guān)性(圖5)。

圖5 ELISA檢測(cè)與臨床樣品檢測(cè)相關(guān)性分析Fig.5 Linear correlation between ELISA and clinical sample

3 討論

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，單克隆抗體的應(yīng)用涉及醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等眾多鄰域，其在基礎(chǔ)研究、蛋白純化、環(huán)境及食品監(jiān)測(cè)、疾病診斷、預(yù)防及治療方面均有不可代替作用[8]。相較于傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù)，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)可以直接從人體外周血中分離出特異性B細(xì)胞，以此為模板擴(kuò)增編碼基因，省去了動(dòng)物源到人源的改造步驟，所制備的全人源化單克隆抗體在治療和研究自身免疫性疾病和人類免疫系統(tǒng)等方面有突出優(yōu)勢(shì)。目前單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于制備多種抵抗病原微生物感染的高度特異性人源抗體，如HIV 抗體、破傷風(fēng)抗體、乙肝抗體、流感抗體等[9-12]。雖然單個(gè)B細(xì)胞法制備單克隆抗體技術(shù)已經(jīng)成為眾多科研機(jī)構(gòu)的重要研究工具，但該技術(shù)涉及到眾多的技術(shù)平臺(tái)和關(guān)鍵技術(shù)。不同的實(shí)驗(yàn)室在圍繞此技術(shù)的不同環(huán)節(jié)各有側(cè)重和優(yōu)勢(shì)，但缺乏對(duì)整套技術(shù)的完整把握，這些問(wèn)題極大地阻礙了該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。隨著B(niǎo) 細(xì)胞分選技術(shù)、后續(xù) PCR 擴(kuò)增基因方法以及抗體基因高通量分析鑒定等方法的成熟和完善，未來(lái)單個(gè)B 細(xì)胞抗體制備技術(shù)仍然將在診斷、藥效學(xué)及臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大作用。本研究將單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)結(jié)合Exip 293真核表達(dá)系統(tǒng)制備的hs-CRP單克隆抗體20#，22#對(duì)重組CRP蛋白以及CRP(+)血清都具有良好的特異性和高靈敏度，達(dá)到了hs-CRP檢測(cè)要求，為進(jìn)一步的免疫檢測(cè)試劑盒研發(fā)及其他檢測(cè)方法體系奠定了良好基礎(chǔ)。