張園園，于利

（1.錦州醫(yī)科大學研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理教研室，遼寧 錦州 121001）

老年性黃斑變性（senile macular degeneration,SMD）是世界范圍內不可逆性致盲眼病，其發(fā)病機制復雜，多種因素參與其發(fā)生、發(fā)展過程；肥胖、高脂血癥患者視網膜變性發(fā)病概率增加[1]。超重和肥胖可引起機體生理功能的改變，如高氧化應激水平，炎癥發(fā)生的風險因子，血脂代謝的失衡，而這些都參與SMD的發(fā)病[2]。血脂異?？墒挂暰W膜色素上皮細胞損害，Bruch膜脂質的沉積并破壞其完整性，并導致脈絡膜毛細血管內皮細胞的病理改變[3]。而視網膜Brucn膜脂質沉積又可引起視網膜色素上皮細胞及感光細胞損傷，使其功能下降，最終引起視力不可逆損傷[4]。

香椿葉是我國著名的食用藥用植物，富含多種活性物質，具有很高的藥用價值。香椿葉提取物（toona sinensis leaf extract, TSLE）主要成分是具有抗癌、抗氧化應激等多種生物活性功能的沒食子酸[5-7]，并且其對機體很多組織具有抗炎及調節(jié)脂代謝等功能[8-9]。本實驗在高脂血癥大鼠視網膜損傷的基礎上，觀察TSLE對脂代謝異常引起的視網膜損傷是否有保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.1.1 模型的復制 24只雄性SD大鼠，鼠齡12周，體重（300±20）g，購自錦州醫(yī)科大學動物中心。所有大鼠自由飲食水，晝夜交替12 h，模型組（16只）胃飼高脂飼料（玉米面30%、膽固醇10%、豬油60%、10 ml/kg），正常組（N組，8只）給予等量生理鹽水。實驗期間每3天稱重，觀察各組大鼠體重增長趨勢。8周后檢測血脂水平，確定模型是否復制成功。

1.1.2 藥物處理 模型復制成功后，模型組隨機分為高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+香椿葉提取物組（HF+TSLE組），每組8只。HF+TSLE組給予香椿葉提取物（1 g/kg）水溶液灌胃，HF組給予等量生理鹽水，4周后對所有大鼠進行閃光視網膜電圖（flash electroretinogram, FERG）檢測，血脂及肝指數(shù)的檢測。各組動物取眼進行石蠟包埋蘇木精-伊紅染色，免疫組織化學和Western blotting檢測視網膜組織中蛋白的表達水平。

1.2 實驗試劑及儀器

復方托吡卡胺滴眼液（長春迪瑞制藥有限公司），抗兔一抗 IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3（美國Cell Signaling Technology公司），抗兔二抗（美國Thermo公司），電生理檢測設備（重慶艾爾曦公司），自動脫水機（德國萊卡公司），多聚甲醛（北京化學試劑公司），DAB顯色劑（丹麥Dako Cytomation公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清血脂及肝臟指數(shù)的檢測 各組大鼠禁食水12 h，1%戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉后心臟取血，檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量；并取肝臟，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，稱肝濕重，計算肝臟指數(shù)。

1.3.2 眼視覺電生理檢查 各組大鼠FERG檢查前暗適應12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，暗室內安放電極，記錄電極置于雙眼角膜上，羥糖苷滴眼液（alcon laboratories, Inc）保持角膜滋潤，參考電極刺入雙耳皮下，接地電極刺入尾部，選擇合適光源及頻率刺激，記錄a波、b波潛伏期及振幅的變化。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色觀察視網膜形態(tài)變化 麻醉后取各組大鼠左側眼球，4%多聚甲醛中固定72 h。自動脫水機脫水，包埋，石蠟切片（厚5 μm），脫蠟，水化，蘇木精染核，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染細胞漿，梯度脫水，中性樹脂封片，光鏡下觀察視網膜組織各層結構，并測量視網膜厚度。

1.3.4 免疫組織化學檢測IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達 選取合適石蠟切片，脫蠟至水，檸檬酸抗原修復液高溫修復抗原，3% H2O2封閉內源性過氧化酶，1% Trition X-100/PBS破膜，3% BSA封閉，分別加入抗兔一抗IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3 4℃過夜，PBS清洗3次，37℃孵育二抗羊抗兔1h，DAB復染，蘇木精染核，常規(guī)脫水封片。

1.3.5 Western blotting檢測IL-6、TNF-a、NF-κB p65、Caspase-3的表達 視網膜組織加入適量含有蛋白酶抑制劑PMSF的裂解液，低溫離心25min，取上清液，BCA法測定蛋白表達水平。取視網膜上清液、上樣緩沖液和PBS混合煮沸使蛋白變性，SDSPAGE電泳分離目標蛋白，濕式電轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，1% BSA室溫封閉1h，一抗4℃搖床過夜孵育。次日，TBST洗膜3次，羊抗兔二抗室溫孵育1h。TBST洗3次，孵育超敏發(fā)光液ECL，暗室顯影。以β-actin作為內參進行校正，所有實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，通過Shapiro-Wilk檢驗確定為正態(tài)性分布，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠體重及肝臟指數(shù)比較

N組、HF組及HF+TSLE組3組大鼠初始體重大致相同。高脂飲食喂飼后，HF組及HF+TSLE組大鼠體重增長較N組增加。8周后，檢測血脂確定高脂血癥模型成功后，開始TSLE治療。治療期間，HF+TSLE組大鼠體重與HF組比較，呈緩慢增長趨勢，至治療4周后，兩組大鼠體重有差異。見圖1。

圖1 3組大鼠體重增長趨勢

3組大鼠肝臟指數(shù)，N組（0.032±0.002）%，HF組（0.041±0.006）%，HF+TSLE組（0.034±0.015）%，3組比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.927，P=0.016）；組間兩兩比較顯示，HF組肝臟指數(shù)較N組增加（P＜0.05），HF+TSLE組肝臟指數(shù)與N組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HF+TSLE組肝臟指數(shù)較HF組降低（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠血清生化指標比較

3組大鼠血清血脂水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HF組與N組比較，TC、TG、LDL-C含量增高，HDL-C含量降低（P＜0.05）；HF+TSLE組TG、LDL-C、TC、HDL-C含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HF+TSLE組與HF組比較，TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C 含量增加（P＜0.05）。見表 1。

2.3 視覺電生理檢測結果

3組大鼠a波潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中，N組與HF組比較，HF組與HF+TSLE組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3組大鼠b波潛伏期、a波振幅和b波振幅比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4 視網膜的組織形態(tài)學改變

N組視網膜各層組織排列緊密規(guī)則，HF組視網膜組織各層排列紊亂，細胞減少，尤其以外核層（ONL）和內核層（INL）減少顯著，HF+TSLE組視網膜損傷狀態(tài)較HF組改善。3組大鼠視網膜總厚度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.567，P=0.003）。進一步兩兩比較顯示，N組和HF+TSLE組較HF組視網膜厚度均增加（P＜0.05）。見圖 2、3。

表1 3組大鼠血清血脂含量 （n =8，mmol/L，±s）

表1 3組大鼠血清血脂含量 （n =8，mmol/L，±s）

注：1）與N組比較，P ＜0.05；2）與HF組比較，P ＜0.05

組別 TG TC LDL-C HDL-C N 組 1.04±0.05 0.88±0.08 0.29±0.05 0.53±0.08 HF 組 1.51±0.391） 1.18±0.311） 0.39±0.061） 0.27±0.061）HF+TSLE 組 1.16±0.212） 0.80±0.052） 0.30±0.042） 0.45±0.062）F值 4.443 5.927 5.535 10.014 P值 0.036 0.016 0.020 0.001

表2 3組大鼠視網膜FERG a波、b波潛伏期及振幅比較 （n =8，±s）

表2 3組大鼠視網膜FERG a波、b波潛伏期及振幅比較 （n =8，±s）

注：1）與N組比較，P ＜0.05；2）與HF組比較，P ＜0.05

組別 a波潛伏期/ms b波潛伏期/ms a波振幅/μV b波振幅/μV N 組 14.17±2.19 40.42±5.49 37.3±16.38 129.13±40.06 HF組 19.71±1.361） 41.39±5.03 35.25±9.83 113.43±29.96 HF+TSLE組 16.17±1.802） 37.96±4.67 29.05±6.39 103.98±23.81 F值 18.053 1.392 0.839 1.893 P值 0.000 0.263 0.441 0.167

圖2 各組大鼠視網膜形態(tài)變化 （HE×400）

圖3 3組大鼠視網膜厚度比較 （n =8，±s）

2.5 視網膜組織IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達

免疫組織化學結果顯示，HF組IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達水平較N組增加，HF+TSLE組較HF組蛋白表達降低；Western blotting結果顯示，3組IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=59.290、13.770、28.340 和 10.090，P=0.017、0.031、0.011和 0.010），HF 組 IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3蛋白相對表達量較N組增加（P＜0.05）；HF+TSLE組蛋白相對表達量較HF組減少（P＜0.05）。見圖 4～11。

圖4 3組大鼠視網膜組織IL-6表達 （免疫組織化學×400）

圖5 3組大鼠視網膜組織IL-6表達 （Western blotting檢測）

圖6 3組大鼠視網膜組織TNF-α表達 （免疫組織化學×400）

圖7 3組大鼠視網膜組織TNF-α表達 （Western blotting檢測）

圖8 3組大鼠視網膜組織NF-κB p65表達 （免疫組織化學×400）

圖9 3組大鼠視網膜組織NF-κB p65表達 （Western blotting檢測）

圖10 3組大鼠視網膜組織Caspase-3表達 （免疫組織化學×400）

圖11 3組大鼠視網膜組織Caspase-3表達 （Western blotting檢測）

3 討論

SMD是一種隨年齡增長和慢性炎癥刺激而發(fā)展的疾病，其發(fā)生和發(fā)展與黃斑區(qū)脂質和蛋白質混合物的沉積密切相關，沉積物的堆積最終導致視網膜細胞的功能缺失或凋亡。高脂血癥時機體脂質的代謝功能受損，長期刺激，極易使視網膜組織遭受損失，大量中性脂質堆積在Bruch膜，該中性脂質的堆積最終形成玻璃膜疣，導致視力下降，造成不可逆的中心視力喪失[10]。目前，臨床上的治療已取得一定成效，但方法局限，因此，找到新的治療方法十分重要。

香椿葉有著悠久的食用藥用歷史，其提取物沒食子酸富含多種生物活性，相關研究發(fā)現(xiàn)[11]，TSLE對4-羥基壬烯酸誘導的視網膜細胞毒性具有保護作用以及在H2O2誘導的APRE-19細胞損傷中能夠抑制促炎因子的表達而發(fā)揮保護作用[12]。

3組大鼠在高脂飲食胃飼后，血清血脂水平增加，TSLE治療后，血清血脂水平較HF組有所下降。視網膜光鏡下HE染色顯示高脂模型組大鼠視網膜變薄，各層排列紊亂，特別是外核層光感受器細胞排列紊亂，細胞凋亡，數(shù)量減少。而白霞等[13]也發(fā)現(xiàn)高脂引起視網膜超微結構的改變主要發(fā)生在外核層的感光細胞體外段視盤及視網膜神經纖維層。TSLE治療后，視網膜各層組織排列較HF組大鼠視網膜排列相對規(guī)則，外核層細胞數(shù)量明顯增加。TSLE對視網膜的保護作用還可通過FERG功能檢測來評估。FERG主要反映視網膜感光細胞到雙極細胞及無長突細胞的功能。a波反映視網膜外層光感受器細胞層的生物電活動，b波是對視網膜雙極細胞電活動的反應，其變化能夠評價視網膜內層的功能狀態(tài)。機體長期代謝異常使視網膜組織內外屏障受損，進而使其轉運物質及代謝水平下降，而視網膜組織的代謝水平對感光細胞維持正常視覺是必不可少的[14]。本研究高脂干預后，HF組大鼠a波潛伏期時間較N組延長，且a波振幅較N組也降低；b波潛伏期及振幅也發(fā)生改變，說明高脂對視網膜外層感光細胞層造成損傷，但對視網膜內層雙極細胞的影響較小。TSLE治療后，HF+TSLE組a波b波潛伏期時間較HF組明顯縮短，視網膜光感受器功能得到顯著提高，但a波和b波振幅在治療后沒有增加，可能與實驗期間電生理檢測時引起角膜損傷相關。

研究表明脂代謝異常引起體內脂質過氧化物增多，脂質積累，玻璃膜疣形成，進而引起眼底慢性炎癥反應[15]，炎癥反應進一步使脂質融合累積。長期炎癥因子的浸潤促使視網膜內多種細胞釋放炎癥介質，造成視網膜損傷，最終使細胞凋亡，而一些炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等已經被證實可以加速SMD的進展[16]。本研究中高脂模型大鼠視網膜組織中炎癥因子IL-6、TNF-α表達水平均升高，另外發(fā)現(xiàn)視網膜組織中NF-κB p65及Caspase-3的表達也增加。NF-κB是一種多效性的核轉錄因子，參與細胞生長、黏附、分化、炎癥及凋亡反應，p65異源二聚體是其發(fā)揮生理功能的重要結構片段。NF-κB p65作為一種多向性調節(jié)蛋白，在細胞內介導多種炎癥表達。IL6、TNF-α等炎癥因子的釋放、堆積誘導核因子NF-κB p65的激活，進而促進Caspase-3的表達增加，引起細胞凋亡。研究表明TSLE對多種組織有抗炎作用，其中包括TSLE對體內體外肺損傷具有抗炎作用[17]；在NF-κB轉基因小鼠實驗中[18]，TSLE通過調控NF-κB p65的表達抑制LPS誘導的炎癥反應。另有相關動物實驗表明[19]，TSLE具有與非甾體抗炎藥物相同的功能作用。本研究中，TSLE對高脂模型大鼠治療后，視網膜組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p65及Caspase-3的表達降低，提示TSLE對高脂大鼠視網膜損傷發(fā)揮保護作用可能是通過IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3信號途徑。

總之，目前的研究結果表明，TSLE是一種潛在的有效預防由于脂代謝異常的食用藥物，為SMD的預防或者治療方法提供一個新的思路。然而TSLE發(fā)揮作用的具體機制是否是通過IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3信號途徑仍需進一步深入研究。