劉孟奇 王小巧 徐璐 郭濤 陳隨清

摘要：采用冰凍切片法、徒手切片法，利用亮視野顯微鏡、熒光顯微鏡、偏振光和掃描電子顯微鏡，對卷丹進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)研究;利用熒光和組織化學(xué)染色的手段對卷丹進(jìn)行組織化學(xué)研究。結(jié)果表明：（1）卷丹鱗葉內(nèi)表皮和外表皮都由1層緊密排列的長方形細(xì)胞構(gòu)成，外表皮細(xì)胞較長，大小為（230±60） μm×（50±10） μm，垂周壁略微彎曲，內(nèi)表皮細(xì)胞大小為（120±30） μm×（70±10） μm，垂周壁微彎曲或淺波狀;內(nèi)表皮和外表皮都分布有少量氣孔，無副衛(wèi)細(xì)胞。（2）卷丹鱗葉有12～16個維管束，導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管。（3）薄壁細(xì)胞所含淀粉粒較多，都為單粒，卵圓形和長橢圓形，臍點偏心，層紋清晰可見。（4）熒光顯微及組織化學(xué)染色表明，生物堿、多酚類和脂類物質(zhì)主要分布在內(nèi)表皮和外表皮細(xì)胞中，而多糖和皂苷類物質(zhì)在內(nèi)表皮、外表皮以及葉肉細(xì)胞中都有分布。卷丹不同部位的表皮、淀粉粒特征較為一致，維管束數(shù)目一定，大小差別較大。組織化學(xué)研究結(jié)果為百合的加工、評價、鑒定及進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：百合;卷丹;顯微;組織化學(xué);鱗葉

中圖分類號：S567.901?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0153-05

收稿日期：2021-04-27

基金項目：第62批中國博士后項目基金（一等）（編號：2017M623342）。

作者簡介：劉孟奇（1971—），男，河南洛陽人，博士，副教授，主要從事中藥資源與鑒定研究。 E-mail：2009liumq@163.com。

通信作者：郭 濤，博士，教授，主要從事中藥資源與中藥新藥開發(fā)研究。E-mail：gt010010@163.com。

2020版《中國藥典》百合項下收載卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium brownii F. E. Brown var. viridulum Baker）和細(xì)葉百合（Lilium tenuifolium DC.）。中藥百合有養(yǎng)陰潤肺、清心安神之功效[1]。中藥百合的主流品種為卷丹和百合，細(xì)葉百合僅見于野生。目前，對于中藥百合及其主要混淆品種的顯微研究仍停留在普通光學(xué)顯微鏡下對淀粉粒、導(dǎo)管和表皮細(xì)胞的簡單描述[2-6]。對于不同生長年限的及其鱗葉不同部位的表皮、淀粉粒和維管束的顯微特征，缺少利用熒光顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行深入的研究?，F(xiàn)行藥典僅有中藥百合的性狀鑒定和薄層鑒定，而無顯微鑒定特征的描述，缺少指標(biāo)成分和量化指標(biāo)[1]。研究表明中藥百合含有皂苷類、酚類、生物堿類、多糖類、磷脂類等活性成分[7-9]。當(dāng)前有關(guān)中藥活性化學(xué)成分的研究大多集中于皂苷類和多糖等方面[10]，而對其他成分的了解非常有限，而且百合的組織化學(xué)定位研究還沒有展開。因此，本研究以卷丹為對象，擬選取一年生栽培卷丹為研究材料進(jìn)行顯微和組織化學(xué)研究，旨在為中藥百合在鑒定、質(zhì)量控制和加工等方面的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卷丹，一年生植物，于2020年9月采集于湖南省邵陽市隆回縣北山鄉(xiāng)北山村（110°5′24.86″E、27°4′46.25″ N，海拔304 m），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)郭濤教授鑒定為卷丹的鱗葉。新鮮材料一部分直接用于制片，一部分用標(biāo)準(zhǔn)固定液（FAA固定液）固定保存。

FAA固定液自制：（甲醛、70%乙醇、乙酸體積比為5 ∶90 ∶5）、改良碘化鉍鉀（Dragendorffs試劑）、固藍(lán)B、0.02%的釕紅、耐爾藍(lán)、香草醛-冰乙酸-高氯酸。

OlympusBX53正置熒光顯微鏡，由日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn);Quorum K850臨界點干燥儀、Quorum SC7620離子濺射鍍膜儀、Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電鏡，均由德國卡爾蔡司公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀鑒別

對采集的新鮮百合鱗莖的外觀進(jìn)行觀察和描述，用刻度尺測量其直徑，對不同位置不同大小的鱗葉的長、寬和厚度進(jìn)行測量，精確到1 mm。用放大鏡在光線明亮處觀察干燥的鱗葉，對邊緣及內(nèi)、外表面和斷面的特征進(jìn)行觀察。

1.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察

采用撕表皮的方法，在不同位置（外、中、內(nèi)層）鱗葉的不同部位（上、中、下）分別撕取外表皮和內(nèi)表皮，一部分樣品用水合氯醛處理后，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，在亮視野下觀察并照相;一部分在紫外光（UV）下觀察并照相。采用徒手切片法將不同位置鱗葉橫切或縱切，一部分樣品用水合氯醛透化處理后，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，在亮視野下觀察內(nèi)表皮、外表皮和維管束的顯微特征并照相;另一部分在紫外光下觀察并照相。選取不同位置鱗葉，切成小塊，采用擠壓法擠出淀粉粒，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，分別在亮視野和偏振光下觀察并照相。

1.2.3 掃描電鏡觀察

取不同位置的新鮮卷丹鱗葉，切成小塊后在FAA固定液中固定10 h，乙醇梯度脫水（分別為 50%、70%、85%、90%乙醇各脫水1次，無水乙醇2次，15 min/次），而后用乙酸異戊酯置換乙醇2次（20 min/次），在Quorum K850臨界點干燥儀中干燥，在Quorum SC7620離子濺射鍍膜儀中噴金，用Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電鏡觀察拍照內(nèi)表皮、外表皮和橫切面。

1.2.4 組織化學(xué)觀察

取不同位置的新鮮鱗葉，采用徒手切片法將鱗葉橫切，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡分別在亮視野和紫外光下觀察并照相。

用徒手切片法對不同位置的新鮮鱗葉橫切制片，或撕取外表皮和內(nèi)表皮，用組織化學(xué)試劑染色：（1）檢測生物堿用改良碘化鉍鉀（Dragendorffs試劑）;（2）檢測酚類用固藍(lán)B;（3）檢測多糖用0.02%的釕紅[11];（4）檢測脂類用耐爾藍(lán)[12];（5）檢測皂苷類用香草醛-冰乙酸-高氯酸。染色后用OlympusBX53正置熒顯微鏡觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀特征

鱗莖扁球形，直徑4～7 cm，鱗葉白色，呈闊卵形，長2～4 cm，寬1.5～2.5 cm，厚度為1.0～2.5 mm，表面較光滑，表面淡黃白色，有5～8條較為清晰的白色維管束平行排列。頂端稍尖，邊緣平整;質(zhì)地較脆，易折斷，斷面較平坦;味微苦。

2.2 鱗葉的顯微特征

2.2.1 外表皮、內(nèi)表皮及葉肉細(xì)胞

卷丹不同位置鱗葉的不同位置的外表皮和內(nèi)表皮特征都由1層排列緊密的長方形細(xì)胞構(gòu)成。外表皮細(xì)胞長方形大小為（230±60） μm×（50±10） μm，垂周壁較為平直或略微彎曲（圖1-A），用熒光顯微鏡在紫外光下觀察到橫向的垂周壁熒光微弱，而縱向的垂周壁熒光較為強(qiáng)烈，呈平行排列式樣（圖1-B）。外表皮上稀疏分布有氣孔，氣孔器為近圓形，大小為（48±2） μm×（50±2） μm，氣孔長軸方向與外表皮細(xì)胞排列方向一致（圖1-A）。掃描電鏡觀察外表皮的外表面較為平滑，垂周壁略微突出，氣孔與表皮細(xì)胞在同一水平（圖1-C）。內(nèi)表皮細(xì)胞也為長方形，大小為（120±30） μm×（70±10） μm，明顯比上表皮細(xì)胞短寬，垂周壁微彎或呈淺波狀，內(nèi)表皮上氣孔少于外表皮，氣孔的大小、方向和形狀與外表皮相似（圖1-D），外表皮和內(nèi)表皮氣孔的長軸方向與鱗葉的長軸方向一致，氣孔周圍都有4個表皮細(xì)胞（圖1-A、圖1-D）。內(nèi)表皮細(xì)胞也為縱行排列，熒光顯微下觀察到垂周壁熒光比上表皮的強(qiáng)烈（圖1-E）。掃描電鏡下觀察到的內(nèi)表皮有些褶皺（圖1-F）。

卷丹鱗葉橫切制片后觀察到外表皮只有1層細(xì)胞，無淀粉粒，無色透明，而葉肉細(xì)胞中充滿淀粉粒（圖2-A）。水合氯醛處理后可以清晰看到外表皮細(xì)胞的寬度和厚度顯著小于相鄰的葉肉細(xì)胞。外表皮細(xì)胞外切向壁較厚，有明顯的角質(zhì)層，外表皮細(xì)胞與相鄰的一層葉肉細(xì)胞結(jié)合緊密（圖2-B）。內(nèi)表皮細(xì)胞也只有1層細(xì)胞，細(xì)胞的寬度和厚度也顯著小于相鄰的葉肉細(xì)胞，橫切觀察到葉肉細(xì)胞為等徑形（圖2-C）。從鱗葉的縱切面觀察，葉肉細(xì)胞為長方形，呈現(xiàn)整齊的縱行排列，因而容易絲狀剝離出來（圖2-D）。

2.2.2 維管束、淀粉粒

橫切制片后觀察，維管束的導(dǎo)管直徑較小，為外韌維管束（圖2-E），熒光顯微鏡下對鱗葉橫切面進(jìn)行觀察，可以看到維管束有2層，總數(shù)在12～16條之間變化，維管束的直徑大小不等，相差較大（圖2-F），大的肉眼可見，小的在顯微鏡下才能觀察到?？v切觀察維管束中的導(dǎo)管類型為螺紋導(dǎo)管（圖2-G）。葉肉細(xì)胞中淀粉粒都為單粒，大多呈長卵形，臍點可見多為點狀，少數(shù)為短縫狀，層紋可見而不顯著（圖2-H），偏振光下觀察臍點位于狹窄一端的靠近邊緣處，偏光十字較為暗淡（圖2-I）。淀粉粒的大小多數(shù)在（20±5） μm× （40±5） μm，最長可達(dá)70μm，其大小變化范圍較大。

2.3 組織化學(xué)

對鱗葉橫切制片觀察發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)表皮和外表皮都只有1層細(xì)胞，無色透明，外切向壁較厚，外表皮的外切向壁比內(nèi)表皮的厚些，且明顯可以看到外面的1層角質(zhì)層（圖3-A），在熒光顯微鏡下有明顯的青色的自發(fā)熒光（圖3-B），而葉肉細(xì)胞則無此特征。外表皮和內(nèi)表皮都很容易剝離，用改良后的碘化鉍鉀試劑染色后，表皮細(xì)胞和氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中都產(chǎn)生橘紅色沉淀，內(nèi)表皮中產(chǎn)生的橘紅色沉淀多于外表皮（圖3-C、圖3-D），葉肉細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)橘紅色沉淀（圖3-E），表明內(nèi)表皮的生物堿含量多于外表皮，葉肉組織中不含生物堿。用固藍(lán)B染色，內(nèi)、外表皮細(xì)胞甚至氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中都產(chǎn)生橘紅色沉淀，表明酚類物質(zhì)存在，并且內(nèi)表皮中產(chǎn)生的橘紅色沉淀多于外表皮（圖3-F、圖3-G），在葉肉細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)橘紅色沉淀（圖3-H）。用釕紅染色發(fā)現(xiàn)，內(nèi)表皮和外表皮都顯示紅色（圖3-I、圖3-J），表明內(nèi)表皮和外表皮細(xì)胞內(nèi)都存在多糖，在葉肉細(xì)胞中也存在有淀粉粒以外的多糖（圖3-K）;用尼羅藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，外表皮和內(nèi)表皮細(xì)胞都顯示藍(lán)色（圖3-L、圖3-M），表明內(nèi)、外表皮細(xì)胞中存在脂類物質(zhì)，在葉肉細(xì)胞中未產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)（圖3-N）。用香草醛-冰乙酸-高氯酸染色發(fā)現(xiàn)，外表皮和內(nèi)表皮細(xì)胞都顯示紅色（圖3-O、圖3-P），表明其中存在皂苷類物質(zhì)，在葉肉細(xì)胞中也存在皂苷類物質(zhì)。組織化學(xué)觀測結(jié)果具體見表1。

3 討論與結(jié)論

2020版《中國藥典》[1]僅有關(guān)于中藥百合性狀的描述，劉暢宇等對中藥百合各個品種及主要混淆品種的性狀進(jìn)行了描述，其中提到卷丹“鱗葉長 2.0～3.5 cm，寬1～3 cm，厚1～3 mm”[3]，本研究卷丹鱗葉的大小與劉暢宇等的描述[3]基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)卷丹鱗葉的表面淡黃白色，與劉暢宇等的描述“表面乳白色或淡黃棕色”[3]略有不同。劉暢宇等描述“維管束數(shù)量在3～8條”[3]，本研究對卷丹不同位置的鱗葉進(jìn)行觀察，用放大鏡能夠清晰看到的維管束數(shù)量在5～8條之間。用熒光顯微鏡對百合斷面觀察可以看到的維管束數(shù)量在 12～16條之間，這是由于部分維管束直徑小，而且被包埋在葉肉細(xì)胞中，使用放大鏡難以觀察到。2020版《中國藥典》[1]對中藥百合描述只提到“有數(shù)條縱直平行的白色維管束”，建議對中藥百合各品種維管束數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計時，選用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察更為精準(zhǔn)。所有維管束的類型都為外韌維管束，導(dǎo)管類型為螺紋導(dǎo)管，劉暢宇等所述的網(wǎng)紋導(dǎo)管[3]在本研究中并未發(fā)現(xiàn)。鱗葉的外表皮和內(nèi)表皮都由1層排列緊密的長方形細(xì)胞構(gòu)成，外表皮和內(nèi)表皮細(xì)胞的長度分別在（230±60） μm和（120±30） μm范圍內(nèi)，有顯著的區(qū)別，這一顯著區(qū)別需要在中藥百合及易混淆品種的研究中深入展開。寬度上分別在（50±2） μm 和（70±10） μm范圍內(nèi)，區(qū)別并不顯著。在外表皮和內(nèi)表皮上都稀疏分布有近圓形的氣孔器，大小相近，周圍一般有4個表皮細(xì)胞。鱗葉的葉肉細(xì)胞在橫切面上觀察為近圓形，縱切面上觀察為長方形，排列成行。

顯微鏡下觀察結(jié)果表明，卷丹不同位置鱗葉的不同部位，外表皮和內(nèi)表皮顯微大小顯著不同，各自都有一定的尺寸范圍，維管束的類型都為外韌型，數(shù)量都在12～16條之間，且導(dǎo)管類型為螺紋導(dǎo)管，都為單粒淀粉粒、臍點靠近狹窄一端，層紋可見而不清晰，偏振光觀察較為暗淡，這些特征都是比較穩(wěn)定的顯微特征，可以作為顯微鑒定的科學(xué)依據(jù)。另一方面，卷丹鱗葉薄壁細(xì)胞中均勻分布有大量的淀粉粒，維管束纖細(xì)且無機(jī)械組織，其顯微特征決定了其飲片具有一些性狀特點：質(zhì)硬而脆，斷面平坦，角質(zhì)樣。

卷丹鱗葉的內(nèi)、外表皮在亮視野下觀察為無色透明，在紫外光下發(fā)出青色的自發(fā)熒光，鱗葉的葉肉細(xì)胞則無此特征。組織化學(xué)染色表明，生物堿、酚類和脂類物質(zhì)都分布在外表皮和內(nèi)表皮中，而多糖和皂苷類在外表皮、內(nèi)表皮和葉肉細(xì)胞中都有分布。卷丹中的活性成分包括多糖、皂苷類、脂類、生物堿和酚類等物質(zhì)，其中活性成分含量最高的是多糖和皂苷類物質(zhì)[13-15]，這與本研究所證明的多糖和皂苷類物質(zhì)在葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞中廣泛分布的結(jié)論一致。

在卷丹鱗葉的內(nèi)表皮和外表皮中分布有酚類和生物堿物質(zhì)，在新鮮的卷丹鱗葉中這些物質(zhì)以溶解狀態(tài)存在于細(xì)胞液中，亮視野下為無色透明，而在紫外光下會產(chǎn)生青色的自發(fā)熒光。酚類是天然化合物中的一大類物質(zhì)，多具抗氧化能力[16-17]，同時也是構(gòu)成植物化學(xué)防御系統(tǒng)的重要組成部分[18]。新鮮的卷丹鱗葉常為白色，在加工和存放過程中由于酚類物質(zhì)氧化變色，因此表面為黃白色至淡棕黃色，有的微帶紫色[1]。生物堿在防御微生物感染和抵御食草動物攝食方面有重要的作用[19-20];卷丹味微苦，其苦味來源主要與內(nèi)表皮和外表皮中分布有少量的生物堿有關(guān)。

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