杜東霞 雷平 吳民熙 王震 劉惠知

摘要：從重金屬污染土壤中分離到1株具有溶鎘和促生長雙重特性的耐鎘根際促生長菌，經(jīng)形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，該菌株初步鑒定為惠州芽孢桿菌（Bacillus huizhouensis sp.），命名為DN14，該菌株具有溶鎘、溶磷、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)吲哚乙酸和固氮的多種性能。盆栽試驗表明，當(dāng)菌株DN14的接種量為 80 mL/盆時，龍葵的促生長效果最顯著，株高增加28.8%，地上部生物量增加40%，地下部生物量增加50%。龍葵根、莖及葉中的鎘含量也均出現(xiàn)明顯的增加，其中根部鎘含量增加與對照相比差異顯著（P<0.05），可達(dá)42.5%，莖和葉中鎘含量分別提高 32.7%和27.9%。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)是一種很有前途的重金屬污染土壤生態(tài)環(huán)保修復(fù)技術(shù)，不僅可以顯著提高植物修復(fù)效率，而且可以改良土壤，為重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)治理提供一種新途徑。

關(guān)鍵詞：鎘;促生長菌;鐵載體;植物修復(fù);龍葵

中圖分類號： S182;X53? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0241-06

收稿日期：2021-05-25

基金項目：湖南省重點研發(fā)項目（編號：2019NK2192）。

作者簡介：杜東霞（1980—），女，山東菏澤人，碩士，高級工程師，主要從事農(nóng)用微生物基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。E-mail：xiaxia414@126.com。

通信作者：劉惠知，碩士，研究員級高級工程師，主要從事農(nóng)用生物基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。E-mail：719641546@qq.com。

近年來，我國土壤環(huán)境問題日益凸顯，據(jù)2014年國家環(huán)境保護(hù)部和國土資源部發(fā)布的全國土壤污染狀況調(diào)查公報，全國近160萬km2土地受到重金屬污染，其中鎘（Cd）的點位超標(biāo)率高達(dá)7.0%[1]。湖南省是全國最大的稻米產(chǎn)區(qū)之一，素有“魚米之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，但同時湖南省也是鎘污染最嚴(yán)重的地區(qū)之一[2]。因此，亟需針對鎘污染農(nóng)田土壤開展修復(fù)技術(shù)研究。

目前，國內(nèi)重金屬污染土壤治理技術(shù)，如化學(xué)沉淀、膜過濾、離子交換、電動力學(xué)技術(shù)等可用于從土壤中去除鎘，但這些方法通常存在成本高昂、副效應(yīng)多、打破土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)等突出問題，因此并不適合用來治理大面積的中輕度重金屬污染耕地[3-4]。近年來，由于微生物所具備的促生長、鎘吸附和鎘活化能力，及其作為修復(fù)載體的低成本和環(huán)境友好的性能，越來越受到研究者的廣泛關(guān)注[5-6]。

目前，發(fā)現(xiàn)的鎘超富集植物已有 60 余種，如東南景天、龍葵、寶山堇菜、蒲公英等，國內(nèi)常用的鎘超累積植物主要是東南景天和龍葵[7-9]。植物修復(fù)技術(shù)在修復(fù)鎘污染土壤中具有成本低廉、技術(shù)簡單、就地修復(fù)等優(yōu)勢，但已發(fā)現(xiàn)的重金屬超富集植物多為草本科，其共同特點是富集效率高，但生物量較小，同時受外部環(huán)境條件的影響，富集效果不甚理想[10]。為解決這一弊端，開展了植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，相關(guān)研究表明，促生菌可通過產(chǎn)生長素（ZAA）、產(chǎn)鐵載體、溶磷解鉀等作用促進(jìn)植物生長;微生物還可通過產(chǎn)有機(jī)酸、分泌胞外酶和產(chǎn)胞外多糖等作用改變根際土壤酸堿性及鎘在土壤中的存在形態(tài)等，進(jìn)而提高植物對鎘污染土壤的修復(fù)效率[11-14]?；诖耍P者所在課題組篩選了1株集耐鎘、溶鎘、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、溶磷和固氮等功能于一身的功能菌株，以此尋求突破植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展瓶頸。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、Ashby培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基、孟加拉紅（PKO）培養(yǎng)基（無機(jī)磷）、MSA培養(yǎng)基[15-17]。

1.1.2 主要試劑

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O，分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);碳酸鎘（CdCO3，分析純），上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn);Salkowski 試劑、鉬銻抗顯色劑和二硝基酚指示劑，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測定分析方法

1.2.1 供試土壤樣品采集

土壤樣品為湖南省某鎘重度污染區(qū)龍葵的根際土壤，抖落植物根系表面松散的土壤，采集緊密附著在根系表面的土（根際土），將其裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌袋中密封，迅速帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存。用于盆栽的土壤為采自0～20 cm深的耕作層土壤，將其除雜、風(fēng)干、粉碎、過10目篩后充分混合，土壤的理化性質(zhì)見表1。

1.2.2 耐鎘根際促生菌的分離

稱取10 g鎘重度污染區(qū)根際土壤樣品，迅速放入盛有90 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中（添加玻璃珠），于 30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，靜置30 min。用10倍梯度稀釋法將土壤懸浮液依次稀釋至10-1、10-2、10-3和 10-4，選擇 10-3和 10-4稀釋液分別涂布在鎘含量為50 mg/L的初篩固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，選擇菌落和形態(tài)差異較大的菌株依次劃線接種到鎘濃度更高（100、150、200 mg/L）的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)菌株生長情況，逐步淘汰抗鎘能力差且生長慢的菌株。挑選耐鎘能力強(qiáng)的優(yōu)異菌株，并將其單菌落在固體培養(yǎng)基上劃線3 次以上進(jìn)行純化，斜面4 ℃保藏用于后續(xù)試驗。

1.2.3 根際耐鎘促生菌的促生性能測定

（1）溶磷能力定性定量測定：分別采用透明圈法和鉬銻比色法定性定量測定菌株的溶磷能力，參照文獻(xiàn)[15]。

（2）產(chǎn)鐵載體定性定量測定：分別采用CAS平板法和630 nm相對吸光度測定法測定菌株產(chǎn)鐵載體的能力，參照文獻(xiàn)[16]。

（3）產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力定性定量測定：分別采用微孔板比色法和530 nm相對吸光度測定法測定菌株產(chǎn)吲哚乙酸的能力，參照文獻(xiàn)[18]。

（4）固氮能力測定：采用點板方法測定菌株的固氮能力，參照文獻(xiàn)[19]。

1.2.4 菌株耐鎘能力測定

配制鎘濃度分別為 20～200 mg/L的LB液體培養(yǎng)基試管并滅菌，鎘的濃度梯度設(shè)置為20 mg/L，菌液的接種量為2%，每個處理3個重復(fù)。試管接種后于30 ℃，140 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，并測定試管中細(xì)菌培養(yǎng)液的D600 nm，通過比較細(xì)菌在不同鎘濃度液體培養(yǎng)基中的生長狀況初步判斷細(xì)菌的耐鎘能力。根據(jù)初步判斷的結(jié)果，再以10 mg/L的鎘濃度梯度遞增或遞減來獲得細(xì)菌對鎘的最低抑制濃度和致死濃度。

1.2.5 菌株活化碳酸鎘能力測定

配制2瓶 100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基并加入碳酸鎘粉末（0.1 g/L;Cd 濃度：65.19 mg/L），其中1瓶接種細(xì)菌（按2%的接種量），另1瓶不加菌液作為對照，于30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，離心收集上清，并過0.22 μm濾膜，濾液用ICP-MS測定溶液鎘濃度。每個處理3個重復(fù)。菌株對碳酸鎘活化率的計算公式如下：

活化率=上清液Cd2+濃度/初始Cd濃度×100%。

1.2.6 菌株對Cd2+的吸附試驗

配制鎘離子起始濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L的 LB 液體培養(yǎng)基，并按2%的接種量接種菌株，于30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，高速離心收集上清，利用ICP-MS測定上清液中的鎘含量，每份樣品設(shè) 3 個重復(fù)。

1.2.7 菌株 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌DNA抽提試劑盒抽提菌株的基因組 DNA。依照細(xì)菌 16S rDNA 中的保守區(qū)設(shè)計并合成引物。引物序列如下：27-F：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492-R：5′-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3′。

PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物純化參照文獻(xiàn)[20]，PCR 產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將測序后的序列與 GenBank數(shù)據(jù)中已有的16S rDNA 序列進(jìn)行相似性分析，利用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 盆栽試驗

盆栽試驗是2020年在湖南省微生物研究院實驗大樓樓頂日光溫室內(nèi)進(jìn)行，盆栽土壤風(fēng)干后過10目篩，采用180 cm×260 cm的灰盆，每盆裝2.5 kg土壤。設(shè)置6個處理，包括菌株DN14接種量分別為20、40、60、80、100 mL/盆的處理，以及不接菌的空白對照（CK），各處理設(shè)置3個平行。

將龍葵種子用去離子水沖洗 3 遍，然后用過氧化氫（5%）浸泡 30 min，再用去離子水反復(fù)沖洗 3 遍，常溫晾干后備用。在大培養(yǎng)皿中鋪上經(jīng)無菌水潤濕的濾紙，再將龍葵種子均勻地分散其上，置于恒溫培養(yǎng)箱中在 28 ℃下催芽2 d。待種子露白后再將其轉(zhuǎn)入蛭石盤中，并保持濕潤，每孔放置 2 粒種子。待幼苗長至 6～7張葉時，移栽至預(yù)先裝好土的花盆中。待龍葵幼苗在花盆中生長 10 d 后，開始施加菌液。將菌株DN14活化培養(yǎng)后，于8 000 r/min離心 5 min 收集菌體，將得到的菌體用無菌水重懸至菌體濃度約為1×108 CFU/mL，即得到待處理菌體懸液。分別在龍葵植株的根際接種20、40、60、80、100 mL（菌體懸液濃度約為1×108 CFU/mL）5個處理，每個處理3 次重復(fù)，同時設(shè)定添加相同體積無菌水的空白對照處理。

1.2.9 龍葵生長指標(biāo)測定

龍葵生長后期，測量龍葵株高，用不銹鋼剪刀將龍葵根、莖、葉分離并分別稱質(zhì)量，105 ℃殺青10 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，并分別測定根、莖、葉的干質(zhì)量。

1.2.10 龍葵Cd含量測定

將烘干后龍葵樣品的根、莖、葉分別粉碎后，用 HNO3-H2O2 （3 ∶1，體積比）法消化，消解后的樣品用去離子水稀釋，采用 ICP-MS法測定樣品內(nèi)鎘含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較（α=0.05），用 OriginPro 8.0繪圖，所有數(shù)據(jù)均為3次試驗平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘促生菌的分離篩選及分子生物學(xué)鑒定

采用梯度濃度稀釋法從重金屬污染土壤中分離篩選出6株耐鎘細(xì)菌。其中菌株DN14對鎘的耐受性最高，可在鎘濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基平板上生長，且生長速度較快。促生長定性試驗表明，該菌株同時具有產(chǎn)吲哚乙酸IAA、產(chǎn)鐵載體和溶磷能力（圖1），并且該菌株可在Ashby無氮瓊脂平板上旺盛生長。BLAST分析表明，菌株DN14 與惠州芽孢桿菌（Bacillus huizhouensis，MT071364.1）的16S rDNA序列相似度達(dá)到99%。對菌株DN14的16S rDNA序列用MEGA7.0分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），初步鑒定菌株DN14為惠州芽孢桿菌（Bacillus huizhouensis sp.）。

2.2 產(chǎn)IAA能力定量

菌株DN14產(chǎn)IAA定量試驗結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)生IAA的能力較強(qiáng)，平均產(chǎn)生水平在（8.8±0.3） mg/L。IAA是植物體中普遍存在的生長素類物質(zhì)，說明DN14具有潛在的促進(jìn)根系生長的能力。

2.3 產(chǎn)鐵載體能力定量

菌株DN14產(chǎn)鐵載體定量試驗結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)生鐵載體的能力較強(qiáng)，產(chǎn)鐵載體活性高達(dá)（38.4±1.5）%，說明DN14能通過較強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體能力螯合鐵元素促進(jìn)植物生長。

2.4 溶磷能力定量

菌株DN14溶磷能力定量試驗結(jié)果表明，該菌株溶磷能力較強(qiáng)，溶磷能力為（29.2±2.0） mg/L，說明該菌株可通過分泌低分子有機(jī)酸，降低pH值使難溶磷或不溶磷轉(zhuǎn)換為植物易于吸收的有效態(tài)磷，進(jìn)而促進(jìn)植物磷元素吸收。

2.5 菌株的 Cd 耐受性和活化性能

菌株DN14在Cd2+濃度為100 mg/L左右時生長受到明顯抑制，其最低致死濃度為170 mg/L。由此可見，細(xì)菌DN14對Cd2+具有較高的耐受性（圖3）。

從表2可見，未接種菌株 DN14對照的培養(yǎng)液pH值為6.64±0.38，接種菌株DN14 的培養(yǎng)液 pH值為4.24±0.09，降低了2.4。與不接菌對照相比，接種 DN14菌株的培養(yǎng)液中有效鎘含量增加了229.9倍，大大增加了溶液中的有效鎘含量。

2.6 菌株對Cd2+的吸附性

從圖4可以看出，溶液不同初始 Cd2+濃度對菌株DN14鎘吸附能力有顯著的影響。在Cd2+濃度為20 mg/L時，鎘的吸附率達(dá)到最高，為65%，隨著 Cd2+濃度的增加，菌株的吸附率呈線性降低。

2.7 菌株處理對龍葵生長指標(biāo)的影響

從圖5可以看出，相對不接種菌株的空白對照，當(dāng)菌株DN14的接種量分別為20、40、60、80、100 mL/盆時，株高相應(yīng)增加了 11.1%、15.5%、22.2%、28.8%、26.7%。當(dāng)菌株DN14的接種量為80 mL/盆時，對龍葵株高的促生長效果最顯著。

相對不接種菌株的空白對照，當(dāng)菌株DN14的

接種量分別為20、40、60、80、100 mL/盆時，地上生物量相應(yīng)增加了13.3%、23.3%、33.3%、40.0%、33.3%（圖6-A）。地下生物量相應(yīng)增加了25.0%、25.0%、12.5%、50.0%、25.0%（圖6-B）。當(dāng)菌株DN14的接種量為 80 mL/盆時，龍葵的地上生物量增加最明顯，可達(dá)40%;地下生物量也增加最明顯，高達(dá)50%。試驗結(jié)果進(jìn)一步表明，菌株DN14的接種量為80 mL/盆（菌液濃度約為 1×108 CFU/mL）時，對龍葵的促生長效果最明顯。

2.8 接種菌株DN14對龍葵富集鎘的影響

從圖7可以看出，相對不接種菌株的空白對照，當(dāng)菌株DN14的接種量為 80 mL/盆時，龍葵根、莖及葉中的鎘含量均出現(xiàn)明顯的增加。其中根部鎘含量增加效果與對照相比差異顯著（P<0.05），可達(dá)42.5%，莖和葉中鎘含量分別提高 32.7%和27.9%。

從表3可以看出，相對不接種菌株的空白對照，接種菌株DN14植株的地上部和地下部的鎘富集量均有增加，其中地下部鎘含量增加達(dá)到顯著水平，可達(dá)42.6%，鎘富集總量增加了9.1 μg/株;地上部鎘富集量提高了30.2%，鎘富集總量增加了49.0 μg/株。

3 結(jié)論與討論

利用鎘超積累植物的高富集能力將土壤中的鎘拔除是一種重要的土壤修復(fù)治理技術(shù)，近年來受到廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)作為一種新的技術(shù)途徑，在鎘污染土壤的修復(fù)治理中應(yīng)用越來越廣泛。它不僅可以改善單獨植物修復(fù)中長期存在的

修復(fù)周期長、植株生物量小等疑難問題，而且可以改良土壤，大幅提高修復(fù)效率[21]。

根際促生菌在土壤中發(fā)揮促生功能主要包括2個方面，一是通過生物固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體等作用有效促進(jìn)植物對土壤中營養(yǎng)元素的吸收;二是通過產(chǎn)生長素（indole-3-acetic acid，簡稱IAA）、赤霉素（gibberellins acid，簡稱GA）等調(diào)節(jié)植物生長[22-24]。本研究在菌株篩選過程中，也是主要從促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收和植物生長發(fā)育這2個方面著手，考察了與此相關(guān)的4項指標(biāo)，即定性定量測定菌株的溶磷、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)IAA的能力，定性測定了菌株的固氮能力，篩選到的6株促生效果好的菌株中，DN14效果最明顯，兼具溶磷、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA和固氮能力，而且該菌株可在鎘濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基平板上正常生長。通過在鎘脅迫下的盆栽試驗，菌株DN14可顯著促進(jìn)龍葵株高的生長，地上部和地下部干物質(zhì)積累。本研究結(jié)果表明，接種菌株DN14促進(jìn)了龍葵在鎘污染環(huán)境中的生長，而且由于促生菌株作用下緩解了鎘脅迫對龍葵的毒害作用。

龍葵植株鎘富集能力測定分析結(jié)果表明，無論是龍葵的地上部分還是地下部分，接種菌株DN14處理根、莖和葉中的鎘含量均有所提升，其中根部鎘富集能力達(dá)到了顯著水平（P<0.05），可達(dá)42.5%，莖和葉中鎘含量也分別提高 32.7%和27.9%。這可能是由于菌株DN14對土壤中鎘的活化作用，也可能是由于接種菌株DN14大幅提高了植株的生物量，帶動了龍葵對土壤鎘的吸收。在接種菌株DN14的處理中地下部鎘含量顯著增加，轉(zhuǎn)移系數(shù)有所減小，可能是由于菌株DN14促進(jìn)了植物地下部鎘的富集，但抑制了鎘向地上部遷移，使莖葉鎘含量降低，從而減輕了鎘對龍葵地上部的毒害。

綜上所述，接種菌株DN14可明顯促進(jìn)龍葵的生長發(fā)育和提高龍葵植株的鎘吸收總量，說明依據(jù)根際促生菌株與宿主植物的有利共生關(guān)系，利用優(yōu)良鎘抗性促生菌株強(qiáng)化超富集植物龍葵的鎘吸收效率是切實可行的。 但菌株DN14促進(jìn)龍葵的生長還受到外界環(huán)境因素（溫度、水分、肥料、土壤理化性質(zhì)等） 的影響，如研究不同鎘污染水平下菌株DN14的次生代謝產(chǎn)物、微生物群落結(jié)構(gòu)組成及微生物酶活性的差異，不同酸堿性土壤條件下鎘存在的形態(tài)差異，因此本研究還有待在大田條件下進(jìn)行驗證。

農(nóng)田的鎘污染涉及面積較廣、治理困難而且治理周期長，在實際操作中更易于采用“邊修復(fù)、邊生產(chǎn)”的修復(fù)模式，既要確保農(nóng)民種田的收益，又要不斷去除土壤中的鎘，確保食品安全[25]。本研究篩選獲得的菌株DN14具有優(yōu)良的促生性能，可利用鎘超富集植物與經(jīng)濟(jì)作物（如油菜、棉花等）間作，間作模式既可強(qiáng)化龍葵富集鎘，又促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)作物的生長發(fā)育，這種龍葵-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)在農(nóng)田土壤的鎘污染修復(fù)中具有較強(qiáng)的可操作性和實用性，為制備田間生態(tài)兼具溶鎘促生功能菌劑奠定了基礎(chǔ)。

本研究篩選了1株兼具溶鎘和促生長雙重功能的菌株，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定為惠州芽孢桿菌（Bacillus huizhouensis sp.），耐鎘濃度達(dá)到100 mg/L。經(jīng)定性和定量試驗測定，該菌株具有顯著的溶磷、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)IAA能力，經(jīng)定性試驗測定，該菌株還具有固氮能力，并且對土壤中不溶性鎘的活化能力突出。有望應(yīng)用于重金屬污染農(nóng)田的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)中，進(jìn)而提高土壤中鎘的生物有效性和解決超累積植物矮小、生長緩慢、生物量低、實際應(yīng)用價值低等制約植物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題。

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