劉百慶，張 斌，許 威，張文成，夏時(shí)海

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 肝膽胰脾中心，天津 300162)

胰腺癌是一種難治性疾病，與其早期轉(zhuǎn)移且診斷困難而延誤治療時(shí)機(jī)有很大關(guān)系，因而研發(fā)針對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物具有重要的臨床價(jià)值。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，它是指上皮細(xì)胞失去極性、細(xì)胞間接觸轉(zhuǎn)變成間質(zhì)樣細(xì)胞的過(guò)程，伴隨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的大量產(chǎn)生，從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[1-2]。在胰腺癌患者中，絕大部分為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)。大量研究證實(shí)，EMT在PDAC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。Panc-1細(xì)胞是一種常見(jiàn)的用于研究PDAC生物學(xué)特性的低分化胰腺癌細(xì)胞株，并且，常見(jiàn)的EMT誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF β1)可通過(guò)激活hedgehog等信號(hào)通路誘導(dǎo)panc-1細(xì)胞構(gòu)建EMT模型[3-5]。已有大量的藥物研究用于對(duì)抗胰腺癌的EMT從而抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[3,5]。氧化苦參堿(oxymatrine,OM)為中藥苦參干燥根中提取的生物堿，具有廣泛的抗腫瘤作用，可抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6-8]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，OM可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與OM可抑制EMT有關(guān)[9-10]。然而，OM對(duì)胰腺癌panc-1細(xì)胞EMT是否有抑制作用及其機(jī)制仍不清楚?；谏鲜鲅芯?，我們?cè)赥GF β1誘導(dǎo)panc-1細(xì)胞構(gòu)建EMT模型的基礎(chǔ)上，利用OM進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)EMT相關(guān)因子的表達(dá)變化；同時(shí)檢測(cè)hedgehog信號(hào)通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達(dá)變化，初步探討OM對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能機(jī)制，為研發(fā)抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株panc-1購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞資源中心；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶公司；OM購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TGF β1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；蛋白Marker購(gòu)自北京索萊寶公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)BD公司；單克隆兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin、兔抗人Snail1、兔抗人Twist1和兔抗人GAPDH 購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)公司；兔抗人Gli2購(gòu)自武漢三鷹公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天公司；垂直板電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；5200Multi自動(dòng)熒光/化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Panc-1細(xì)胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的孵育箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Control組)、模型組(TGF β1∶10 ng/mL)[3-5]、OM治療組 (TGF β1 10 ng/mL+OM 1 mg/mL)[7-8,11]、OM對(duì)照組(OM:1 mg/mL)。待細(xì)胞增至70%～80%接觸率時(shí)用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基饑餓4 h后加入OM，作用0.5 h后再加入TGF β1，OM作用24 h，TGF β1作用48 h后終止培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 Transwell法測(cè)細(xì)胞侵襲力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的panc-1細(xì)胞計(jì)數(shù)，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配成2.5×105/mL的細(xì)胞懸液；在24孔板中加入500 μL含血清的DMEM培養(yǎng)基，而后將提前涂過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室放入其中，每個(gè)小室上室加入配制好的細(xì)胞懸液200 μL，周?chē)子肈-Hank’s緩沖液填充；設(shè)如上4組，37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)48 h；而后取出小室， PBS緩沖液清洗3次后分別以4%多聚甲醛固定20 min、0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min；用棉簽除掉上室面細(xì)胞，顯微鏡下觀察各組穿透到下室面的細(xì)胞數(shù)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及Gli2表達(dá) 超聲裂解法提取各組panc-1細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定濃度后電泳分離，條件為恒壓80 V、30 min之后調(diào)至120 V至分離完畢，樣品量20 μg；電泳結(jié)束后以90 V恒壓90 min冰浴下將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將目的蛋白條帶置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉3 h；加入相應(yīng)的一抗稀釋液(E-cadherin、Twist1、Gli2稀釋度為1∶500，Vimentin、Snail1、GAPDH稀釋度為1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗稀釋液(稀釋度1∶10 000)室溫中孵育3 h，再次以TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參，Image J軟件測(cè)取條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OM對(duì)panc-1細(xì)胞侵襲力影響 為研究OM對(duì)胰腺癌panc-1細(xì)胞侵襲力影響，首先以TGF β1誘導(dǎo)panc-1細(xì)胞構(gòu)建EMT模型。如圖1所示，與對(duì)照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細(xì)胞后，侵襲到小室下室面細(xì)胞數(shù)量明顯增加；OM(1 mg/mL)干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)量減少；單獨(dú)以O(shè)M刺激panc-1細(xì)胞，與對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯改變。上述結(jié)果表明OM可能是通過(guò)抑制EMT發(fā)生抑制了panc-1細(xì)胞的侵襲。

與對(duì)照組相比，*:P<0.05；與TGF β1組相比，#： P<0.05。圖1 OM對(duì)panc-1細(xì)胞侵襲力影響

2.2 OM對(duì)TGF β1刺激的panc-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細(xì)胞后，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Twist1表達(dá)上調(diào)；同時(shí)，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin表達(dá)上調(diào)。OM(1 mg/mL)干預(yù)后，上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。單獨(dú)的OM對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)影響(見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組相比，*:P<0.05；與TGF β1組相比，#: P<0.05。圖2 OM對(duì)TGF β1刺激的panc-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響

2.3 OM對(duì)TGF β1刺激的panc-1細(xì)胞中Gli2表達(dá)影響 與對(duì)照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細(xì)胞后，hedgehog信號(hào)通路核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2表達(dá)上調(diào)。OM(1 mg/mL)干預(yù)后，上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。單獨(dú)的OM對(duì)Gli2蛋白表達(dá)無(wú)影響(見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比，*：P<0.05；與TGF β1組相比，#： P<0.05。圖3 OM對(duì)TGF β1刺激的panc-1細(xì)胞中Gli2蛋白表達(dá)影響

3 討論

胰腺癌是惡性程度極高的惡性腫瘤之一，被稱(chēng)為“癌中之王”。在我國(guó)，其死亡率位于消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的第4位，近年來(lái)發(fā)病率有明顯增高的趨勢(shì)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查表明，胰腺癌死亡率正以每年0.3%的速度增加，5年生存率僅為6%～8%[12]。根治性的手術(shù)治療是最有效的治療方式之一，然而胰腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，約80%患者就診時(shí)轉(zhuǎn)移已發(fā)生，尸檢中更是發(fā)現(xiàn)約90%患者都存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1,13]，因而研究胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、研發(fā)有效的抗轉(zhuǎn)移藥物對(duì)于延長(zhǎng)胰腺癌患者的生存周期有著重要的意義。

EMT是胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，大量的研究已經(jīng)證實(shí)胰腺癌細(xì)胞在多種信號(hào)通路、microRNAs等的調(diào)節(jié)下，通過(guò)啟動(dòng)EMT導(dǎo)致上皮細(xì)胞間連接的關(guān)鍵蛋白E-cadherin、ZO-1表達(dá)減少，同時(shí)細(xì)胞獲得極性，使遷移侵襲能力得到增強(qiáng)[1-5]。TGF β1是常用的EMT誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞株panc-1構(gòu)建EMT模型[3-5]。我們的實(shí)驗(yàn)中，10 ng/mL的TGF β1刺激panc-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞侵襲力得到明顯增強(qiáng)；同時(shí)，Western blot結(jié)果表現(xiàn)為EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1 、Twist1及間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin表達(dá)上調(diào)而上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明EMT模型建立成功。在此基礎(chǔ)上，我們探討了OM對(duì)胰腺癌EMT的作用。OM是課題組前期一直研究的一種中藥提取物，具有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗癌和抗纖維化等，但具體機(jī)制尚未研究清楚[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，OM可以抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的侵襲力，但其與EMT之間的關(guān)系還不清楚[8]。除胰腺癌之外，OM還可以抑制其他腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[6,15-17]，特別是OM可以通過(guò)抑制EMT進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[9-10]。在其他方面，有研究發(fā)現(xiàn)OM可以通過(guò)抑制EMT進(jìn)而抑制胰腺、肺、腎等器官的纖維化[18-20]，提示OM對(duì)EMT具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，OM作用于TGF β1刺激的panc-1細(xì)胞后，細(xì)胞增強(qiáng)的侵襲力得到抑制；同時(shí)，EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)，提示OM對(duì)胰腺癌EMT具有抑制作用。然而，單獨(dú)使用1 mg/mL的OM對(duì)panc-1細(xì)胞的侵襲力及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響并不明顯，其原因可能與panc-1細(xì)胞分化程度低、OM作用濃度及時(shí)間不足等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。上述研究結(jié)果表明，OM可能日后作為單一或聯(lián)合其他化療藥物用于胰腺癌的臨床治療。

最后，我們初步探討了一下OM抑制胰腺癌panc-1細(xì)胞EMT的可能機(jī)制。多種信號(hào)通路都可參與調(diào)節(jié)TGF β1誘導(dǎo)的胰腺癌EMT過(guò)程。馬笛等[21]在研究大蒜素對(duì)TGF β1誘導(dǎo)的胰腺癌EMT抑制作用中發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路可能參與了panc-1細(xì)胞EMT的發(fā)生。此外，TGF β1/Smad、Akt/mTOR、MAPK、hedgehog等信號(hào)通路也參與了TGF β1誘導(dǎo)的胰腺癌EMT發(fā)生[22-25]。另一方面，Jun二聚化蛋白2(Jun dimerization protein 2,JDP2)、Rac1b、DNA甲基化結(jié)合蛋白3 (Methyl-CpG-binding domain 3,MBD 3)等蛋白還可通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)MAPK、TGF-β/Smad等信號(hào)通路進(jìn)而抑制TGF β1誘導(dǎo)的胰腺癌EMT發(fā)生[26-28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)OM也可以通過(guò)抑制TGF β1/Smad、NF-κB等信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程[9-10]。值得關(guān)注的是，hedgehog信號(hào)通路廣泛參與了胰腺癌EMT過(guò)程。Gli蛋白家族是hedgehog信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子，其中，Gli1、Gli2均有轉(zhuǎn)錄激活作用，在胰腺癌EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4,29]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF β1誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞后通過(guò)募集Smad3結(jié)合到Gli2的啟動(dòng)子區(qū)誘導(dǎo)Gli2的表達(dá)，后者表達(dá)又可進(jìn)一步上調(diào)Gli1的表達(dá)[30]。并且課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，OM可抑制TGF β1誘導(dǎo)的panc-1細(xì)胞中Smad3/Gli1的表達(dá)[31]。然而，OM對(duì)Gli2是否也有抑制作用未有研究。我們的實(shí)驗(yàn)中，TGF β1刺激panc-1細(xì)胞后Gli2表達(dá)上調(diào)；OM干預(yù)后，Gli2表達(dá)被抑制，結(jié)合課題組前期結(jié)果，提示OM對(duì)hedgehog信號(hào)通路具有一定的抑制作用。

綜上所述，TGF β1誘導(dǎo)panc-1細(xì)胞構(gòu)建EMT模型后給予OM進(jìn)行干預(yù)，panc-1細(xì)胞的侵襲力及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)受到抑制；同時(shí)，OM還抑制了TGF β1刺激引起的hedgehog信號(hào)通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2的高表達(dá)，結(jié)合研究已證實(shí)hedgehog信號(hào)通路參與調(diào)控胰腺癌的EMT過(guò)程及OM對(duì)胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的Gli1亦具有抑制作用，提示OM抑制EMT進(jìn)而抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能與OM對(duì)hedgehog信號(hào)通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli1/2的抑制有關(guān)，豐富了OM的抗癌機(jī)制，為今后的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供參考。