呂建偉,李小鵬,謝振麗,朱 琨,謝志剛,徐興軍,王昌河,,*

1 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 齊齊哈爾 161006 2 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 西安 710049

寒冷是北方野生小哺乳動(dòng)物經(jīng)常遇到的環(huán)境壓力, 溫度作為自然環(huán)境中最重要的影響因子之一, 對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、取食消化、代謝產(chǎn)熱與繁殖活動(dòng)等都會(huì)產(chǎn)生顯著的影響[1- 4]。作為動(dòng)物處理、消化、吸收食物和獲得能量的重要器官,消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響動(dòng)物對(duì)食物的攝取和能量的吸收,進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖。消化道大小和形態(tài)的自我調(diào)節(jié)是動(dòng)物獲能策略的重要組成部分,是動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境條件與自身生理需求作出的響應(yīng)和適應(yīng)性調(diào)整,其變化與環(huán)境溫度、食物質(zhì)量[5-8]以及繁殖狀況[9-10]等因素密切相關(guān)。因此,研究長(zhǎng)期冷暴露下小型嚙齒動(dòng)物消化道形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)的變化不僅有助于理解小型動(dòng)物在低溫環(huán)境下的取食與消化對(duì)策,還對(duì)理解生物在極端溫度環(huán)境下的能量代謝及其適應(yīng)性調(diào)整具有重要的生物學(xué)意義。

小型動(dòng)物主要通過(guò)消化道容積的改變和消化道壁組織結(jié)構(gòu)的改變來(lái)調(diào)節(jié)其形態(tài)結(jié)構(gòu),以適應(yīng)其在不同環(huán)境及其不同生理?xiàng)l件下的能量需求。在環(huán)境溫度低、能量需求增加或食物質(zhì)量下降的情況下,為滿足代謝需求,小型恒溫動(dòng)物通常會(huì)增加消化道容積或道壁組織結(jié)構(gòu)以提高攝食量或提高消化效率。如, 張志強(qiáng)和王德華[11]對(duì)能蒙古太仆寺旗的長(zhǎng)爪沙鼠腸道長(zhǎng)度的季節(jié)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)其小腸和大腸長(zhǎng)度在春冬季最長(zhǎng)、夏季最短。朱萬(wàn)龍等[12]發(fā)現(xiàn)橫斷山區(qū)大絨鼠小腸和盲腸長(zhǎng)度隨溫度降低而顯著增加。Del Valle等[13]則發(fā)現(xiàn)冷暴露條件下南美原鼠(Akodonazarae)小腸的長(zhǎng)度和鮮重均大于對(duì)照組。宋志剛等人[14]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期冷暴露孕鼠(Microtusbrandti)的胃、小腸、盲腸和結(jié)腸鮮重明顯高于溫暖環(huán)境下的孕鼠和非繁殖期雌鼠。目前大多的研究報(bào)道主要集中在消化道的長(zhǎng)度及重量的變化上,認(rèn)為較長(zhǎng)的消化道長(zhǎng)度意味著較大的腸腔容量,而較大的鮮重和干重則代表較復(fù)雜的腸道微結(jié)構(gòu)和更為有效的消化與吸收效率[13]。

腸道是由腸絨毛、腸腺、毛細(xì)血管、毛細(xì)淋巴管及內(nèi)層環(huán)肌與外層縱肌等組成的多層次的復(fù)雜而精密的組織結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)的可變性與多變性是引起腸道組織針對(duì)外界環(huán)境做出適應(yīng)性調(diào)整的重要方式。一般認(rèn)為消化道容積的改變可能是由消化道長(zhǎng)度或管徑的變化引起的,而其組織結(jié)構(gòu)的變化主要表現(xiàn)為微絨毛數(shù)量、漿膜厚度、管壁厚度及其他組織結(jié)構(gòu)的變化。因此,長(zhǎng)度和重量?jī)蓚€(gè)簡(jiǎn)單的指標(biāo)無(wú)法真正體現(xiàn)腸道組織精細(xì)而復(fù)雜的可塑性變化[15]。如,Dou等的研究結(jié)果表明限制飲食將導(dǎo)致大鼠小腸萎縮,表現(xiàn)為絨毛長(zhǎng)和隱窩深的顯著降低[16]。 Samanya和Yamauchi發(fā)現(xiàn)喂食B. subtilis natto會(huì)抑制氨的產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)而導(dǎo)致小腸絨毛長(zhǎng)度增加[17]。眾所周知，低溫條件可以引起小型哺乳動(dòng)物能量需求的增加，然而, 小型哺乳類腸道組織結(jié)構(gòu)的變化目前還不清楚。本研究對(duì)小鼠各腸道組織結(jié)構(gòu)(消化道各器官的長(zhǎng)度、鮮重、干重以及十二指腸的腸壁總厚度、絨毛高度、內(nèi)半徑、外半徑)在長(zhǎng)期冷暴露條件下所做出的適應(yīng)性變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析,不僅對(duì)長(zhǎng)期處于低溫條件下的小鼠消化道形態(tài)變化研究,同時(shí)對(duì)小鼠消化道形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)-橫截面積在低溫環(huán)境下的適應(yīng)性調(diào)整進(jìn)行了系統(tǒng)研究,這為深入理解小型哺乳類在低溫環(huán)境下的消化策略及其適應(yīng)模式具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為20日齡的昆明小鼠,將其隨機(jī)分為常溫對(duì)照飼養(yǎng)組(25℃)和低溫飼養(yǎng)組(10℃)飼養(yǎng),除溫度外其他飼養(yǎng)條件相同。飼養(yǎng)過(guò)程中每日打掃鼠舍,添加鼠糧(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)及清水,每5日采用精度為1 g的電子秤測(cè)量小鼠體重,共馴化3個(gè)月。

1.2 消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)量

按0.6 mL/100 g體重腹腔注射10%的水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)將實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉,首先使用300 mL的生理鹽水進(jìn)行心臟灌流,原則是先快后慢。生理鹽水灌流結(jié)束后,改用200 mL 4% 的多聚甲醛進(jìn)行預(yù)固定,小心的取出胃腸器官,置于生理鹽水中,分離出胃(stomach,ST)、小腸(small intestine,SI)、大腸(large intestine,LI)及盲腸(caecum,CA),小心剔除腸系膜及其他組織,以生理鹽水沖凈內(nèi)容物,平展為最大長(zhǎng)度,但不要拉伸,采用精度為1 mm的軟尺測(cè)量小腸、盲腸、大腸的長(zhǎng)度(length, L),胃長(zhǎng)采用精度為0.02 mm的游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量；取十二指腸近胃2 cm處的片段,置于10%的甲醛溶液中固定,以備組織切片；用濾紙吸干剩余部分后用精度為0.1 mg的電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,BSA6202S-CW)稱取各器官鮮重(empty,E)；然后將各器官置于60℃烘箱內(nèi)烘干12 h,待重量穩(wěn)定后稱其重量并記錄。

1.3 消化道組織結(jié)構(gòu)觀察與測(cè)量

十二指腸為食物消化與營(yíng)養(yǎng)吸收的主要場(chǎng)所,因此本研究采用十二指腸作為主要實(shí)驗(yàn)材料,經(jīng)12—24 h的固定后,經(jīng)常規(guī)的水洗、脫水、透明、浸蠟和包埋處理,在室溫下用德國(guó)Leica組織切片設(shè)備進(jìn)行切片,切片厚度約8m,切片用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行染色,封固后用德國(guó)Zeiss激光掃描共聚焦顯微鏡LSM510進(jìn)行觀察。選取絨毛完整、走向平直的經(jīng)典視野采集圖像,并用Zeiss LSM Image Browser (Version 3.0)進(jìn)行定量分析,測(cè)定腸道截面積、腸腔截面積、腸壁總厚度、絨毛高度、絨毛寬度、直腸的環(huán)肌層厚度和縱肌層厚度等生理指標(biāo),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

成像數(shù)據(jù)使用Zeiss LSM Image Browser(Version 3.0)和MBF ImageJ(NIH)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,各指標(biāo)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SE)表示,采用Student′st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為是差異顯著。所有統(tǒng)計(jì)分析借助SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化道的形態(tài)學(xué)變化

常溫及低溫組小鼠的體尺測(cè)量及消化道各器官(胃、小腸、大腸、盲腸)的長(zhǎng)度、鮮重與干重測(cè)量結(jié)果如表1所示。低溫飼養(yǎng)小鼠的體重(P<0.05)、消化道總長(zhǎng)(P<0.01)均明顯增加。胃長(zhǎng)、胃鮮重、胃干重在兩組小鼠之間均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05),提示胃容量和組織結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境溫度變化的敏感性較低。低溫組小鼠的小腸長(zhǎng)度顯著增加(P<0.001),但其鮮重卻明顯降低(P<0.05)。低溫小鼠大腸的長(zhǎng)度和鮮重均未發(fā)生顯著變化(P>0.05),其干重顯著增加(P<0.05)。在長(zhǎng)期冷暴露下,小鼠盲腸的長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05)、但其鮮重和干重卻未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

表1 常溫與低溫組小鼠消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

2.2 十二指腸組織結(jié)構(gòu)變化

運(yùn)用組織切片技術(shù)分別對(duì)兩組小鼠十二指腸的外徑截面積、內(nèi)徑截面積、外徑截面積-內(nèi)徑截面積、絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和腸壁總厚度以及直腸的截面積、環(huán)肌層厚度和縱肌層厚度進(jìn)行觀察和比較(圖1),進(jìn)而分析長(zhǎng)期冷暴露對(duì)小鼠消化道各項(xiàng)組織學(xué)指標(biāo)的影響,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。低溫組小鼠的腸道和腸壁組織截面積均顯著減少(P<0.05),而腸腔隙截面積則未發(fā)生顯著變化(P>0.05),暗示其腸道組織在低溫環(huán)境下發(fā)生萎縮。與此相一致,低溫組小鼠的腸壁厚度也顯著減小(P<0.05)。與腸壁厚度降低相反,低溫組小鼠的絨毛高顯著增加(P<0.001),而其寬度則未發(fā)生明顯變化(P>0.05),提示其黏膜層厚度增加,而黏膜下層結(jié)構(gòu)則趨于萎縮。在低溫飼養(yǎng)條件下,小鼠十二指腸的肌肉層厚度顯著增加(P<0.01)。

圖1 常溫與低溫飼養(yǎng)小鼠十二指腸的組織切片F(xiàn)ig.1 Representative micro-graphs of duodenal sections of mice maintained at 25℃ (Control) or 10℃The intestinal tissue was fixed with 10% formaldehyde solution, dehydrated in ascending series of ethanol, cleared in xylene, embedded in paraffin, sectioned, and stained with haematoxylin and eosin. The sections were observed with a Laser Scanning Confocal Microscope (LSM510, Zeiss). Scale bars: 500 μm for upper panels, 200 μm for middle panels, and 50 μm for lower panels

指標(biāo)Item低溫組Lower temperature 10℃常溫對(duì)照組 Control 25℃P腸道截面積 Section area/mm22.9059±0.14903.4851±0.19430.038*腸腔截面積 Lumen area/mm20.3693±0.05400.3599±0.02380.888腸壁截面積 Wall area/mm22.5066±0.12093.1253±0.18180.021*腸壁厚 Wall thickness/μm550.3±11.94589.7±13.240.044*絨毛高 Villus height/μm409.7±12.89330.0±12.920.0001***絨毛寬 Villus width/μm76.1±3.6283.5±2.720.11肌層厚 Muscle thickness/μm17.5±0.9713.9±0.780.002**

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001

3 討論

寒冷是北方野生小哺乳動(dòng)物冬季生存所要面臨的最重要的環(huán)境壓力之一, 作為動(dòng)物處理、消化、吸收食物和獲得能量的重要器官,消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出極大的可塑性,以適應(yīng)它們?cè)诘蜏丨h(huán)境下的能量獲取與分配的需求。然而,小型哺乳類腸道組織結(jié)構(gòu)是如何隨外界環(huán)境變化而發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性調(diào)整的目前還不清楚。本研究首次對(duì)小鼠消化道形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)在低溫環(huán)境下的適應(yīng)性調(diào)整進(jìn)行了系統(tǒng)研究,結(jié)果表明,低溫小鼠腸道組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)均已經(jīng)產(chǎn)生了適應(yīng)性調(diào)整,它們主要通過(guò)增加消化道的長(zhǎng)度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積來(lái)增加食物攝取量、營(yíng)養(yǎng)的吸收速率和吸收效率等,進(jìn)而滿足其在低溫條件下能量需求的增加。

低溫飼養(yǎng)小鼠的體重(P<0.05)、消化道總長(zhǎng)(P<0.01)均顯著增加,表明小鼠可能在寒冷環(huán)境下對(duì)能量需求很高,并通過(guò)提高消化道容納能力而獲得更多的能量。同時(shí),低溫組小鼠的小腸長(zhǎng)度顯著增加(P<0.001),腸腔橫截面積沒(méi)有發(fā)生明顯變化,提示小鼠腸道容量明顯增加,表明小鼠在寒冷環(huán)境下主要通過(guò)提高食物在小腸中的滯留時(shí)間和消化吸收面積而獲得能量收支。低溫組小鼠盲腸長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05),暗示在寒冷環(huán)境下代謝率下降、食物利用率低下,小鼠可能通過(guò)增加盲腸長(zhǎng)度而額外獲得部分能量。胃長(zhǎng)、胃鮮重、胃干重在兩組小鼠之間均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05),提示胃容量和組織結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境溫度變化的敏感性較低。小腸,十二指腸,盲腸在寒冷環(huán)境下的變化表明消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出極大的可塑性,以適應(yīng)它們?cè)诘蜏丨h(huán)境下的能量需求。

十二指腸的組織結(jié)構(gòu)測(cè)量結(jié)果表明,低溫組小鼠的腸道和腸壁組織截面積均顯著減少(P<0.05),而腸腔隙截面積則未發(fā)生顯著變化(P>0.05),暗示其腸道組織在低溫環(huán)境下發(fā)生萎縮。與此相一致,低溫組小鼠的腸壁厚度也顯著減小(P<0.05)。與腸壁厚度降低相反,低溫組小鼠的絨毛高顯著增加(P<0.001),而其寬度則未發(fā)生明顯變化(P>0.05),提示其黏膜層厚度增加,而黏膜下層結(jié)構(gòu)則趨于退化,表明小鼠在寒冷環(huán)境下通過(guò)提高消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力而增加能量獲取。在低溫飼養(yǎng)條件下,小鼠十二指腸的肌肉層厚度顯著增加(P<0.01),表明小鼠在寒冷環(huán)境下可以增加消化道蠕動(dòng)力而增加消化與吸收效率。這些研究結(jié)果表明,小型哺乳動(dòng)物在寒冷環(huán)境下主要通過(guò)提高腸道組織的容納量與黏膜層厚度及腸道蠕動(dòng)能力等來(lái)提升單次攝食量、食物消化與營(yíng)養(yǎng)吸收效率等來(lái)滿足其高體溫調(diào)節(jié)價(jià)下的能量需求。

綜上所述,本研究首次在組織水平研究了小型哺乳動(dòng)物的消化道結(jié)構(gòu)及其消化策略在低溫環(huán)境下的適應(yīng)性調(diào)整,它們主要通過(guò)增加消化道長(zhǎng)度、腸道表面積及肌肉層厚度等來(lái)提高其食物消化和營(yíng)養(yǎng)吸收效率,以便更好地適應(yīng)環(huán)境溫度變化導(dǎo)致的能量需求變化。