鮑華燁

310000杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

色素性疾病(包括色素沉著及色素減退疾病)是臨床中最常見的皮膚病大類之一，其具體的發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，而黑素細(xì)胞已被公認(rèn)為決定皮膚顏色的關(guān)鍵因素之一。黑素細(xì)胞的培養(yǎng)在研究色素性皮膚疾病中顯得極其重要。大量研究表明，某些細(xì)胞因子對黑素細(xì)胞生物學(xué)活性有重要調(diào)控作用。既往研究顯示，α-黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)及干細(xì)胞生長因子(SCF)對黑素細(xì)胞的增殖、活性均有重要影響?；诖耍狙芯繑M探究不同濃度的4種細(xì)胞因子對體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞的影響，構(gòu)建正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，分析α-MSH、bFGF、ET-1及SCF與黑素細(xì)胞的增殖、黑素的合成以及酪氨酸酶活性的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

材料和儀器：LDopa、Ham F-12培養(yǎng)基、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、牛胰島素、SCF、ET-1、α-MSH、DMSO及MTT均購自美國Sigma公司，10%新生小牛血清和EDTANa2均購自美國Gibco公司，牛垂體提取物(BPE購于美國Invitrogen公司。青霉素100 IU/mL，氫化可的松0.5 mg/L，鏈霉素100 IU/mL，苔盼藍(lán)，胰蛋白酶均系國內(nèi)產(chǎn)品。培養(yǎng)瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司。Wellscan MK3型酶標(biāo)儀(Labsystems公司)。 SYBR?Premix Ex TaqTM(日 本TaKaRa公司)，2 倍 Taq Master Mix(美國OMEGA公司)， MTS試 劑 盒 (美國OMEGA公司)。CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀系美國Bio-Rad公司，梯度PCR儀購于德國Eppendorf公司。引物均由上海生工生物有限公司合成。經(jīng)患者知情同意后，標(biāo)本取自18～36歲行包皮環(huán)切術(shù)的健康成人包皮。

方法：①細(xì)胞培養(yǎng)：按照Halaban方法進(jìn)行[1]。簡述如下：取環(huán)切術(shù)切下的包皮，去除皮下組織，Dispase酶4℃消化過夜，將其表、真皮分離，用0.02%EDTA+0.25%胰酶消化表皮15 min，將其接種于培養(yǎng)瓶中以10個/cm2細(xì)胞密度。使用TICVA培養(yǎng)基于5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基，之后保持3次/周的更換頻率進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。接種后的黑素細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的瓶底時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。進(jìn)行試驗(yàn)取第3～4代的細(xì)胞，在試驗(yàn)過程中選用的培養(yǎng)基不含BIMX和TPA。

細(xì)胞增殖的測定：采用MTT法測定黑素細(xì)胞的增殖[2]，分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設(shè)8個復(fù)孔。以藥物處理組A490/對照組A490的百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞酪氨酸酶活性測定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設(shè)8個復(fù)孔。用藥物處理組A490/對照組A490的百分?jǐn)?shù)表示酪氨酸酶活性。

細(xì)胞黑素含量測定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20 μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設(shè)8個復(fù)孔。黑素含量用藥物處理組A490/對照組A490的百分?jǐn)?shù)表示。

研究細(xì)胞酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)mRNA表達(dá)水平：將細(xì)胞按照5×105/mL的濃度接種到6孔板中，1 d后依次選用4種細(xì)胞因子和新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行1次換液處理，72 h后收集細(xì)胞。按照Trizol說明書分別提取各細(xì)胞總RNA，測定RNA純度和濃度采用紫外分光光度計(jì)。逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，RT反應(yīng)條件：65℃10 min，55℃30 min，85℃5 min。PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成之后，稱取反應(yīng)液進(jìn)行電泳處理，同時對其PCR產(chǎn)物加以確認(rèn)。PCR擴(kuò)增。real-time PCR樣品經(jīng)95℃預(yù)變性30 s后，按95℃5 s、60℃30 s進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束之前，對其熒光產(chǎn)物的量經(jīng)由Light-Cycle系統(tǒng)自行檢測。然后經(jīng)由實(shí)時熒光定量PCR儀上獲取到溶解、擴(kuò)增曲線和Ct值。GAPDH基因引物(363bp)序列：F 5 "-TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3 "；TYR基因引物(705bp)序列：F5 "-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3 "； R 5 "-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3 "；R 5 "-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3 "。

流式細(xì)胞術(shù)檢測：細(xì)胞培養(yǎng)以后，依照2×105/孔將其轉(zhuǎn)接到6孔板中，濃度100μg/L的α-MSH、bFGF、ET-1及SCF各處理組和單純培養(yǎng)基對照組，對細(xì)胞進(jìn)行72 h處理后收集各處理組的上清液，將其置于離心管中，然后向里面加入0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞(不含EDTA)，然后進(jìn)行懸液的收集并將其轉(zhuǎn)移到與之相對應(yīng)的上清液的離心管中，以1 500 r/min行離心處理，離心時長3 min，完成后將上清液棄去，向里面加入無菌PBS重懸細(xì)胞團(tuán)塊，以同樣條件進(jìn)行離心處理，重復(fù)3次之后，將上清液棄去，向里面加入PI溶液，將其在室溫條件下暗處孵育0.5 h，完成后行上機(jī)檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所測數(shù)據(jù)采用成組t檢驗(yàn)，使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

結(jié) 果

對黑素細(xì)胞增殖的影響：SCF試驗(yàn)組和單純培養(yǎng)基組相比，黑素細(xì)胞的增殖未見明顯的變化，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而bFGF、ET-1、α-MSH各試驗(yàn)組均比單純培養(yǎng)基組黑素細(xì)胞增殖明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，該結(jié)果表明bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素細(xì)胞的增殖。

對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響：加入bFGF和ET-1的各組黑素細(xì)胞明顯增強(qiáng)了酪氨酸酶活性和合成黑素能力，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且bFGF和ET-1也能明顯促進(jìn)黑素合成(P＜0.05)，激活酪氨酸酶(P＜0.01)。而 SCF、α-MSH 作用后，黑素細(xì)胞合成黑素能力增強(qiáng)，P＞0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)無意義，與對照組相比細(xì)胞的酪氨酸酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對黑素細(xì)胞酪氨酸酶、TRP-1 mRNA表達(dá)的影響：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4種細(xì)胞因子作用于黑素細(xì)胞72 h后，黑素細(xì)胞酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表達(dá)均比空白培養(yǎng)基組的表達(dá)增加顯著(P＜0.05)。其中bFGF試驗(yàn)組酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表達(dá)較其他3組表達(dá)略增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

黑素細(xì)胞凋亡率：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH作用于黑素細(xì)胞72 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組黑素細(xì)胞凋亡率分別為5.1%、5.6%、4.9%、5.5%，空白培養(yǎng)基組黑素細(xì)胞凋亡率6.8%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

討 論

既往研究表明，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細(xì)胞因子影響黑素細(xì)胞的功能[3]。在本研究中，我們選取4種公認(rèn)的細(xì)胞因子，系統(tǒng)比較了該4種細(xì)胞因子對黑素細(xì)胞和酪氨酸酶的影響。酪氨酸酶作為合成黑素過程中最為重要的一種酶直接關(guān)系著黑素的合成。而TRP-1作為黑素體膜上的一種糖蛋白，有非常重要的作用，其能阻止未成熟的黑素細(xì)胞死亡，在黑素合成過程中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[4]。抑制該基因以后會抑制黑素細(xì)胞的增生，使酪氨酸酶活性下降[5]。

本研究的結(jié)果表明，bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素細(xì)胞的增殖，并且bFGF和ET-1均能提高酪氨酸酶活性，加速黑素合成。而SCF對黑素細(xì)胞的增殖無顯著影響，SCF和α-MSH對黑素細(xì)胞合成黑素能力及酪氨酸酶活性均無明顯作用。對黑素細(xì)胞的凋亡均無顯著影響是bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4種細(xì)胞因子。黑素細(xì)胞的生長受細(xì)胞因子、角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞間連接等多種因素調(diào)控。bFGF是成纖維細(xì)胞的一種有絲分裂原，主要作用在來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的組織細(xì)胞。研究還發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞、細(xì)胞因子以及黑素細(xì)胞間連接等因素與黑素細(xì)胞的生長有著緊密的關(guān)聯(lián)。而bFGF作為成纖維細(xì)胞的一種有絲分裂原，其大多來源于神經(jīng)外胚層和中胚層的組織細(xì)胞。相關(guān)研究顯示，該細(xì)胞因子借助磷酸化的黏著斑激酶能夠促進(jìn)黑素細(xì)胞發(fā)生遷移[6]。α-MSH作為肽類激素的一種，其在黑素細(xì)胞的分裂過程中發(fā)揮重要的作用，該物質(zhì)的前體是前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素，其對黑素的影響主要通過和MC1R發(fā)生結(jié)合后借助cAMP信號通路發(fā)揮效用。

本研究提示，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH均可影響黑素細(xì)胞的生長和增殖，其中ET-1和bFGF都對酪氨酸酶的活性以及黑素細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。但是對其具體作用機(jī)制還不是很了解，有待進(jìn)一步研究。