邢瀟 張航 徐彤彤 劉治民 楊建龍 曲艷麗

摘?要：

目的：通過對藜蘆莖葉常規(guī)檢驗(yàn)及特征檢驗(yàn)方法的研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與開發(fā)利用提供依據(jù)。方法：采用性狀鑒定、顯微特征及TLC法對其進(jìn)行定性鑒別;通過水分、總灰分、酸不溶性灰分等常規(guī)檢查方法對其進(jìn)行藥材質(zhì)量考察;通過HPLC法測定其活性成分白藜蘆醇含量，進(jìn)一步考察其藥材質(zhì)量。結(jié)果：10批樣品TLC斑點(diǎn)清晰，分離度好;水分測定值在6.4%～10.6%之間;總灰分測定值在8.5%～13.4%之間;酸不溶性灰分測定值在1.0%～2%之間;白藜蘆醇含量在0.007%～0.030%之間。討論：所選性狀、顯微及TLC方法可有效鑒別藥材真?zhèn)?所選水分等常規(guī)檢查方法可在一定程度反映藥材質(zhì)量;所選HPLC方法專屬性強(qiáng)，分離度好，方法穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞：

藜蘆莖葉;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);試驗(yàn)研究

中圖分類號：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230006

藜蘆莖葉為百合科植物藜蘆（Veratrum nigrum L.）的干燥莖葉，主產(chǎn)于東北、華北、西北、內(nèi)蒙古等地。藜蘆具有吐風(fēng)痰、定癲癇等作用，用于痰涎涌盛，癲癇喉痹;外用治療小兒消化不良性腹瀉，腸炎等;還有祛痰，催吐，殺蟲之效[1，2]。中醫(yī)用于治療中風(fēng)失語及痰壅、黃疸、久拒、喉癖、鼻息、泄痢、頭痛、濟(jì)癬等?，F(xiàn)代藥理研究表明，藜蘆具有抗氧化、降血壓作用[3];藜蘆中某些成分還具有抗血栓以及增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮功能以改善高血壓時(shí)的心臟超負(fù)荷狀態(tài)等作用[4]。藜蘆化學(xué)成分主要為甾體生物堿類化合物、茋類化合物、二肽類、黃酮類及其它類化合物。其中茋類化合物白藜蘆醇（C14H12O3）為藜蘆中的主要藥理活性成分之一。藜蘆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，古本草及各省標(biāo)準(zhǔn)中常選用根及根莖作為其藥用部位，但考慮其根及根莖中的有毒生物堿成分較多，故部分省市也應(yīng)用其地上部分作為藥用部位[1，5-9]。目前藜蘆莖葉尚無國家飲片炮制標(biāo)準(zhǔn)，而其各省標(biāo)準(zhǔn)也較為落后，不能有效地控制藜蘆莖葉的藥材質(zhì)量，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫切需要提高。

1?儀器與試劑試藥

生物顯微鏡BX51（OLYMPUS）;1260高效液相色譜儀（Agilent）; GR-202電子天平（日本A＼＼D公司）;KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）;101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;SX2-4-10型高溫箱式電爐（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）等;中藥手工切片刀（深圳眾達(dá)）。

藜蘆莖葉對照藥材（長春市食品藥品檢驗(yàn)中心自制并經(jīng)專家鑒定，批號：201607）;白藜蘆醇對照品（中檢院，批號：111535-201703）;色譜甲醇（Fisher Chemical）;乙醇（北京化工廠）等。共選擇10批樣品為2015年5月—2016年10月之間采集，均為野生樣品，并經(jīng)過吉林中醫(yī)藥大學(xué)教授鑒定為百合科植物藜蘆的干燥莖葉，見表1。

2?方法與結(jié)果

2.1?性狀

根據(jù)收集到的樣品進(jìn)行性狀研究，其性狀特征大致如下：本品全長約30～100cm，莖圓柱狀，中空，表面灰綠色或棕褐色，莖基部常殘留黑褐色網(wǎng)狀纖維;葉片橢圓形，基部抱莖，全緣，兩面無毛，具數(shù)條明顯的平行脈;體輕質(zhì)脆，氣微。

2.2?顯微特征

植物可以通過具有專屬性的顯微特征而進(jìn)行真?zhèn)蔚蔫b別。通過顯微鏡下觀察各樣品的粉末，發(fā)現(xiàn)其有以下顯微特征：本品粉末呈黃綠色或棕褐色，淀粉粒較多，呈圓形或橢圓形，直徑4～20μm，多為單粒，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或呈人字狀;草酸鈣針晶成束或散列于薄壁細(xì)胞中，長約40～150μm;導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，亦有網(wǎng)紋導(dǎo)管及梯紋導(dǎo)管，直徑12～80μm;葉表皮細(xì)胞中可見氣孔，大小不一。

2.3TLC鑒別

經(jīng)對不同展開條件進(jìn)行選擇，結(jié)果顯示，取本品粉末2g，加甲醇30mL，超聲處理20min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液。另取藜蘆對照藥材同法制成對照藥材，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版 通則0502[10]）試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。該方法省時(shí)、簡便、直觀，并可以有效對藥材真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。

2.4檢查

對藥材的常規(guī)檢查可以有效地評價(jià)藥材的優(yōu)劣，主要按《中國藥典》2015年版四部通則對藥材的檢查要求進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分的檢查，其結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：10批樣品的水分測定值在6.4%～10.6%之間;總灰分測定值在8.5%～13.4%之間;酸不溶性灰分測定值在1.0%～2%之間。

2.5?含量測定

為確保藜蘆莖葉藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性、專屬性及可控性，采用高效液相色譜法測定藜蘆中有效成分—白藜蘆醇，按照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0512）進(jìn)行測定。

2.5.1?色譜條件

試驗(yàn)結(jié)果表明： 白藜蘆醇經(jīng)DAD光譜掃描，在306nm處有最大吸收，考慮其基線平穩(wěn)程度，并根據(jù)參考文獻(xiàn)中白藜蘆醇的檢測波長[11]，確定306nm為其測定波長。

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，分別以乙腈-水、甲醇-水為流動相，不同流動相比例，不同柱溫、不同流速下進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，乙腈-水（20∶80）可以將白藜蘆醇成分有效分析，且分離度不受柱溫及流速的影響。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水（20∶80）為流動相;檢測波長為306nm。進(jìn)樣量10μL，柱溫25℃，流速1.0mL/min。理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.5.2?提取方法

取同一批次樣品粉末約0.5g，加不同溶劑，采用不同處理方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水（20∶80）為流動相;檢測波長為306nm。進(jìn)樣量10μL，柱溫25℃，流速1.0mL/min進(jìn)行樣品提取方法學(xué)考察，結(jié)果顯示最佳提取方法為：取本品粉末約0.5g，精密稱定，加甲醇50mL，超聲處理（功率400W，頻率45kHz）40min，過濾，濾液為供試品溶液。10批樣品中白藜蘆醇的含量測定結(jié)果見表1，色譜圖見圖3。

2.5.3?方法學(xué)驗(yàn)證與結(jié)果

2.5.3.1?線性及范圍

取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL中含4.864μg（1）及0.0206mg（2）的溶液，搖勻，作為對照品溶液。精密吸（1）1μL，（2）1μL、2μL、5μL、10μL、16μL、18μL，注入液相色譜儀，測定，計(jì)算。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制白藜蘆醇對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，白藜蘆醇在2.904～13.794μg范圍內(nèi)，峰面積與白藜蘆醇呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y = 29944X +22.626，相關(guān)系數(shù)r = 0.9993。

2.5.3.2?耐用性

分別試驗(yàn)3個(gè)不同品牌的C18色譜柱進(jìn)樣，測定?？疾椴煌放频纳V柱對待測成分色譜峰的分離效果。

色譜柱a：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）柱

色譜柱b：Agilent C18 （4.6mm×250mm，5μm）柱

色譜柱c：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）柱

白藜蘆醇平均含量為0.024%、n=3、RSD=3.4%。結(jié)果顯示;各品牌的色譜柱均能將白藜蘆醇色譜峰達(dá)到基線分離，樣品中各色譜峰峰型及分離度均較好。

2.5.3.3?重復(fù)性

取同一批次藜蘆莖葉藥材，按上文確定的提取方法制備供試品溶液6份，測定白藜蘆醇的含量，結(jié)果白藜蘆醇的平均含量為0.0240%、n=6、RSD=2.9%;說明本方法的重復(fù)性良好。

2.5.3.4?儀器精密度

取重現(xiàn)性項(xiàng)下的一份供試品溶液，按上述色譜條件，精密吸取供試品溶液10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測定白藜蘆醇的峰面積，結(jié)果白藜蘆醇的平均峰面積為460.001282、n=6、RSD=0.2%。說明儀器精密度良好。

2.5.3.5?準(zhǔn)確度

取重現(xiàn)性試驗(yàn)同批次樣品（白藜蘆醇含量：0.0240%）9份，每份取約0.5g，精密稱定，再分別加入3種比例白藜蘆醇對照品適量，按標(biāo)準(zhǔn)正文含量測定項(xiàng)下方法制備供試品，進(jìn)樣，測定其中白藜蘆醇的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果3種比例白藜蘆醇的平均回收率分別為105.07%、n=9、RSD=3.1%。說明本方法回收率良好。

2.5.3.6?穩(wěn)定性

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0h，6h，12h，24h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果白藜蘆醇的平均峰面積為741.4033625、n=6、RSD=1.7%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4?樣品含量測定結(jié)果

該方法簡單易操作，重復(fù)性與分離度均較好。結(jié)果顯示樣品中白藜蘆醇含量在0.007%～0.030%之間?？紤]原料藥產(chǎn)地、加工及生產(chǎn)等因素以及采收時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)白藜蘆醇含量差異較大。

3?討論

各省份關(guān)于藜蘆地上部分的藥材標(biāo)準(zhǔn)相對落后，已不能有效地評價(jià)藜蘆莖葉藥材的質(zhì)量。本研究參照了中國藥典2015版藥材標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)的相關(guān)要求，通過性狀特征可有效將其與不同來源及易混淆品種的藜蘆如毛穗藜蘆、尖被藜蘆、狹葉藜蘆等進(jìn)行區(qū)別[12，13];顯微特征、TLC等項(xiàng)可以進(jìn)一步有效鑒別藥材真?zhèn)?，TLC方法斑點(diǎn)清晰、分離度好;水分、灰分、總灰分及酸不溶性灰分檢查等項(xiàng)可以有效評價(jià)藥材的質(zhì)量;通過多條件篩選后的HPLC法可有效測定藜蘆莖葉中活性成分白藜蘆醇的含量。該方法簡單易操作，可重復(fù)性及準(zhǔn)確度良好，有利于其標(biāo)準(zhǔn)限度的制定及合理用藥。

綜上，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方法可以作為藜蘆莖葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參考，并為藜蘆莖葉藥材的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

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作者簡介：

邢瀟（1983-），女，博士，副主任藥師。研究方向：中藥材及飲片的質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。