許彥明 張震 陳永忠

摘要：以不同樹(shù)齡油茶的葉片為試驗(yàn)材料，研究不同樹(shù)齡油茶葉片的葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的變化狀況，分析葉片生理指標(biāo)隨樹(shù)齡的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在不同樹(shù)齡的油茶樹(shù)中，二年生葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和Chl a+Chl b含量均顯著高于一年生葉片;古樹(shù)二年生葉片的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量最高，分別為1.57、0.12、1.69 mg/g;在不同樹(shù)齡的油茶樹(shù)中，二年生葉片中丙二醛（MDA）和過(guò)氧化氫（H2O2）含量均高于一年生葉片中的含量;在古樹(shù)中，一年生葉片中的MDA和H2O2含量分別為13.61 nmol/g、131.06 μg/g，均高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù);在古樹(shù)中，一年生葉片中的脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均偏高，部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)隨樹(shù)齡越低而逐漸減少，且低于二年生葉片中的含量;在壯齡樹(shù)中，二年生葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均高于一年生葉片，且古樹(shù)葉片中的SOD、POD和CAT活性均明顯強(qiáng)于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)。油茶古樹(shù)有較高的酶活性，能有效清除植物衰老過(guò)程中自身代謝所產(chǎn)生的活性氧（ROS）等物質(zhì)，使古樹(shù)依然保持著正常的生理代謝活動(dòng)。

關(guān)鍵詞：油茶古樹(shù);抗衰老;葉片;葉綠素含量;生理特性

中圖分類號(hào)： S794.401 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0188-03

植物衰老指植物的某個(gè)器官或整個(gè)植株生命功能的衰退并最終導(dǎo)致其自然死亡的一系列變化過(guò)程，是植物生長(zhǎng)發(fā)育周期中一個(gè)重要的生理現(xiàn)象[1]。植物衰老過(guò)程受到多種因素的影響，生物因素包括植物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系、自身基因等[2]，非生物因素主要包括不良外界環(huán)境導(dǎo)致的干旱、鹽堿、高溫、低溫以及重金屬等脅迫逆境[3-4]。葉片是植物重要的生長(zhǎng)器官，植物衰老的主要外部特征表現(xiàn)是生長(zhǎng)速率下降、葉片變黃、脫落，生理特性表現(xiàn)是葉片中氮（N）、磷（P）、鉀（K）、銅（Cu）等含量降低，鈣（Ca）、鎂（Mg）等含量增加[5]。在生命周期的不同階段，隨著年齡的增加，植物生長(zhǎng)速率降低，抗逆性能力下降，光合作用減弱，細(xì)胞內(nèi)一系列抗氧化酶表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。對(duì)古樹(shù)而言，在細(xì)胞器中發(fā)生的漸進(jìn)性功能衰退及細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化，都會(huì)直接影響古樹(shù)的代謝平衡，干擾古樹(shù)的正常生長(zhǎng)，其中葉片的衰老是程序性細(xì)胞死亡的特殊退化過(guò)程[6]。植物葉片中葉綠素含量的高低和降解的速率可作為衡量植物衰老與否和衰老快慢的重要標(biāo)志[7];同樣，隨著葉片中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶活性的降低，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）等保護(hù)酶活性的降低以及可溶性蛋白含量、可溶性糖含量等部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的降低，作為植物衰老指標(biāo)的丙二醛（MDA）含量會(huì)增加，進(jìn)而加速其衰老進(jìn)程。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物衰老的生理特性研究很多，并取得了一些成果。孫艷等發(fā)現(xiàn)，MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率（REC）及POD活性隨黃瓜葉片逐漸衰老而顯著升高，光合色素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD與CAT活性顯著降低[8]。在古油松衰弱衰老樹(shù)中，針葉長(zhǎng)度、葉綠素含量、MDA含量及SOD活性等生理指標(biāo)均不及幼樹(shù)[9]。朱利君等對(duì)珙桐葉的研究發(fā)現(xiàn)，珙桐葉POD活性和MDA含量對(duì)生長(zhǎng)期敏感，同樹(shù)齡同葉位的珙桐葉隨葉片的生長(zhǎng)和衰老，POD活性和MDA含量逐漸升高，且不同樹(shù)齡、葉位、層次的POD活性和MDA含量存在差異[10]。薛秋華等發(fā)現(xiàn)，古槐葉片中N、P、Mg元素含量低于幼槐，Ca、鐵（Fe）、錳（Mn）含量則高于幼槐，K元素含量在古槐和幼槐葉片中基本相同[11]。

關(guān)于植物衰老指標(biāo)的研究有很多[12-14]，這些研究能夠從生理特性方面揭示植物衰老進(jìn)程，為古樹(shù)復(fù)壯、更新、瀕危樹(shù)種的保護(hù)等研究提供一定的參考。油茶作為我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，生命周期長(zhǎng)達(dá)數(shù)百年。目前，關(guān)于油茶的研究主要集中在高效栽培[15-16]、育種[17-18]、繁育及加工利用[19]等方面，關(guān)于油茶古樹(shù)衰老中光合色素、酶活性等生理特性的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)測(cè)定不同樹(shù)齡油茶葉片的相關(guān)生理指標(biāo)，如葉綠素、抗氧化系統(tǒng)酶、部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等，比較不同樹(shù)齡油茶的葉片生理生化指標(biāo)與樹(shù)齡之間的差異，以期明確油茶古樹(shù)抗衰老的生理特性，為油茶古樹(shù)的樹(shù)勢(shì)評(píng)價(jià)、日常養(yǎng)護(hù)管理以及復(fù)壯、保護(hù)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

研究地位于湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)（113°01′30″E，28°06′40″N）。該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫17.5 ℃，年日照時(shí)數(shù)為1 841.8 h，年平均降水量為 1 378 mm，年平均相對(duì)濕度為81%;土壤系第四紀(jì)紅色黏土網(wǎng)紋層母質(zhì)發(fā)育的酸性紅壤，pH值在4.5～5.5之間。

1.2 供試材料

于2017年6月中旬，選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好的油茶幼樹(shù)（6年）、壯齡樹(shù)（30年）、古樹(shù)（>100年）的優(yōu)良單株進(jìn)行采樣。在6月下旬，分別采取每個(gè)單株樹(shù)冠外圍中上部受光相對(duì)一致、健壯、無(wú)病變損傷的一年生和二年生功能葉片作為試驗(yàn)材料（3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。采集的葉片裝入塑封袋并編號(hào)，迅速放入冰盒并帶回實(shí)驗(yàn)室，用去離子水擦洗干凈后，置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮浸提法;超氧化物酶活性的測(cè)定采用核黃素-氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法;過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法;過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法;脯氨酸含量的測(cè)定采用茚三酮顯色法;可溶性糖含量的測(cè)定采用比色法;可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法;丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法;過(guò)氧化氫含量的測(cè)定采用三氯乙酸比色法。葉片相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、作圖，用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與方差分析。同一樹(shù)齡不同年齡葉片的生理指標(biāo)差異顯著性采用成對(duì)t檢驗(yàn)法，不同樹(shù)齡同一年齡葉片的生理指標(biāo)差異顯著性采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差異法。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶葉片中葉綠素含量的變化

不同樹(shù)齡油茶葉片的葉綠素含量存在明顯差異（表1）。從樹(shù)齡看，除幼樹(shù)Chla含量外，3種樹(shù)齡油茶的二年生葉片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b的含量均顯著高于一年生的葉片。其中，油茶古樹(shù)的二年生葉片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b 的含量分別為1.57、0.12、1.69 mg/g，分別比一年生葉片高0.45、0.03、0.48 mg/g。

3種樹(shù)齡油茶的一年生油茶葉片中，葉綠素含量隨樹(shù)齡的增加均呈現(xiàn)先降后增的趨勢(shì)。古樹(shù)葉片的Chl a、Chl a+Chl b含量最高，分別為1.12、1.21 mg/g，其次為幼樹(shù)和壯齡樹(shù)。而在二年生油茶葉片中，葉綠素含量隨樹(shù)齡的增加而升高，古樹(shù)的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量均顯著高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，分別是幼樹(shù)的1.78、1.09、1.71倍。

2.2 油茶葉片中MDA、H2O2含量的變化

3種樹(shù)齡油茶的二年生葉片的MDA和H2O2含量均顯著高于一年生葉片的含量;其中，古樹(shù)的二年生葉片中MDA含量最高，為22.88 nmol/g，是一年生葉片含量的 1.68 倍;壯齡樹(shù)二年生葉片中H2O2含量最高，為416.26 μg/g（表2）。

3種樹(shù)齡油茶的一年生油茶葉片中MDA和H2O2含量變化趨勢(shì)一樣，均隨樹(shù)齡的增長(zhǎng)而增加;古樹(shù)葉片中MDA和H2O2含量最高，分別為13.61 nmol/g、131.06 μg/g，其次為壯齡樹(shù)，分別為12.77 nmol/g、118.07 μg/g，幼樹(shù)葉片中的MDA和H2O2含量最低，分別為7.83 nmol/g、110.04 μg/g。在二年生葉片中，古樹(shù)葉片中的MDA含量最高，為22.88 nmol/g，壯齡樹(shù)葉片中H2O2含量最高，為416.26 μg/g。

2.3 油茶葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

古樹(shù)一年生葉片中3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均高于二年生葉片中的含量（表3），分別為8.58 μg/g、23.83 mg/g、17.15 mg/g。壯齡樹(shù)一年生葉片中脯氨酸和可溶性蛋白含量高于二年生葉片，可溶性糖含量顯著低于二年生葉片。而幼樹(shù)一年生葉片僅有可溶性蛋白含量顯著高于二年生葉片，為27.24 mg/g。

隨著油茶樹(shù)樹(shù)齡的增加，一年生葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量逐漸增加，在古樹(shù)葉片中的含量最高，分別是幼樹(shù)葉片中含量的6.70、1.15倍，而可溶性蛋白含量在古樹(shù)中遠(yuǎn)低于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，僅為17.15 mg/g。二年生葉片中的脯氨酸含量變化趨勢(shì)不同于一年生，古樹(shù)葉片中脯氨酸含量最高，為8.58 μg/g，而可溶性糖和可溶性蛋白的最大含量分別出現(xiàn)在幼樹(shù)和壯齡樹(shù)，分別為30.63、25.90 mg/g。

2.4 油茶葉片中SOD、POD和CAT活性的變化

在3種樹(shù)齡油茶中，二年生葉片中SOD活性顯著高于一年生葉片中酶活性，尤以古樹(shù)葉片中SOD活性最高，為898.37 U/g;雖然二年生葉片POD活性在壯齡樹(shù)和幼樹(shù)中略高于一年生葉片，但3種樹(shù)齡不同年齡葉片中POD活性之間差異不顯著;除幼樹(shù)葉片中CAT活性以外，其他樹(shù)齡不同年齡葉片中CAT活性差異不顯著（表4）。

3種樹(shù)齡油茶的一年生油茶葉片中，古樹(shù)葉片中SOD活性為372.52 U/g，顯著低于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，而POD和CAT的活性顯著高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，分別為34.68、585.91 U/（g·min）。二年生葉片中，古樹(shù)葉片中SOD、POD、CAT酶活性最高，分別為 898.37 U/g、25.31 U/（g·min）、487.64 μg/（g·min），其次是壯齡樹(shù)葉片中的酶活性，幼樹(shù)葉片中的酶活性最低（表4）。

3 結(jié)論與討論

葉綠素是植物進(jìn)行高效光合作用的保證，葉綠素的降解也是植物葉片衰老的主要標(biāo)志[20]。在本試驗(yàn)中，隨油茶樹(shù)齡的增加，相同葉齡的油茶葉片中葉綠素含量在古樹(shù)中明顯高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，這在一定程度上反映出油茶古樹(shù)葉片內(nèi)的生命活動(dòng)更為活躍，且葉片中葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值有所增加，這與戚元春等對(duì)古樟樹(shù)（Cinnamomum camphora）的研究結(jié)果[21]相一致。在小麥的生長(zhǎng)過(guò)程中，葉片中葉綠素a和葉綠素b含量的比值產(chǎn)生了變化，衰老葉片中葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值增加[22]。但關(guān)于古樹(shù)中葉綠素含量高于其他樹(shù)齡的樹(shù)種少有報(bào)道，油茶古樹(shù)葉片中葉綠素含量高于幼樹(shù)的生理機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

可溶性糖可維持生理代謝反應(yīng)場(chǎng)所的滲透平衡動(dòng)態(tài)[23]，可溶性蛋白作為各種新陳代謝反應(yīng)的催化劑，也與葉綠素形成色素蛋白復(fù)合體，影響植物光合作用。李東林等比較了黃山松不同齡階針葉衰老指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨樹(shù)齡增加，可溶性蛋白含量與葉綠素含量的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)關(guān)系[24]。本試驗(yàn)結(jié)果，二者之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能是由于古樹(shù)自身存在的自我修復(fù)能力，樹(shù)勢(shì)逐漸增強(qiáng);油茶古樹(shù)中可溶性糖和可溶性蛋白的含量低于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，而脯氨酸含量在古樹(shù)中有所增加，這可能與可溶性糖和可溶性蛋白分解有關(guān)[25-26]，增加的脯氨酸與可溶性蛋白和可溶性糖一同維持葉片細(xì)胞滲透壓，保持了內(nèi)生物膜的完整性[27]，延緩植物衰老進(jìn)程。

脯氨酸同時(shí)還是一種抗氧化劑，與SOD、POD、CAT等抗氧化酶協(xié)同作用，清除細(xì)胞器產(chǎn)生的H2O2、·OH等活性氧（ROS），緩解ROS對(duì)細(xì)胞的氧化損壞[28]。植物衰老中積累的ROS對(duì)生物體具有毒害效應(yīng)，加速植物的衰老[29-30]。在本試驗(yàn)中，古樹(shù)二年生葉片中SOD活性要明顯強(qiáng)于壯齡樹(shù)和幼樹(shù);而POD和CAT活性在古樹(shù)不同年齡葉片中均高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)。由3種酶活性與MDA含量變化的響應(yīng)來(lái)看，油茶古樹(shù)的MDA含量并沒(méi)因樹(shù)齡的增加而遠(yuǎn)高于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，H2O2含量的增幅也低于壯齡樹(shù)和幼樹(shù)，同時(shí)表現(xiàn)出較高的SOD、POD、CAT活性，這與古樹(shù)葉片內(nèi)抗氧化酶的活性調(diào)節(jié)是密不可分的。MDA和H2O2積累越多表明植物受到活性氧的傷害越大[29-30]，油茶古樹(shù)中MDA和H2O2的含量仍處在較低的水平，抗氧化酶有效地清除了植物衰老過(guò)程中自身代謝所產(chǎn)生的ROS，古樹(shù)依然保持正常生理代謝活動(dòng)。