董岸杰，于立霞，馬金鳳，鄧聯(lián)東，張建華, 3

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雙響應(yīng)脂質(zhì)體納米凝膠的構(gòu)建及性能

董岸杰1, 2，于立霞1，馬金鳳1，鄧聯(lián)東1，張建華1, 3

(1. 天津大學化工學院，天津 300072；2. 天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072；3. 天津大學天津膜科學與海水淡化技術(shù)重點實驗室，天津 300072)

針對抗癌藥物難以在腫瘤部位精準控制釋放的問題，設(shè)計了一種雙重響應(yīng)脂質(zhì)體納米凝膠載體．通過模板原位聚合方法，本文構(gòu)建了pH和還原雙敏感的脂質(zhì)體納米凝膠(pH/R-lipogels)，其中包括pH敏感的脂質(zhì)體膜和二硫鍵交聯(lián)的氧化還原敏感納米凝膠內(nèi)核．通過激光粒度儀和透射電鏡研究了pH/R-lipogels的粒徑分布和形貌，結(jié)果證明pH/R-lipogels粒徑分布較窄且呈現(xiàn)出規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)．體外藥物釋放實驗結(jié)果表明，載藥雙敏感脂質(zhì)體納米凝膠(DOX@pH/R-lipogels)能夠快速響應(yīng)pH值和GSH濃度的變化，提高阿霉素鹽酸鹽(DOX)的釋放速率．體外細胞實驗顯示，DOX@pH/R-lipogels在腫瘤細胞微環(huán)境的刺激下，DOX能夠被有效地釋放進而促進4T1細胞凋亡．這些結(jié)果表明脂質(zhì)體納米凝膠在藥物遞送系統(tǒng)中具有很大的潛力并為膜材料的研究奠定了基礎(chǔ)．

脂質(zhì)體；納米凝膠；雙敏感；藥物遞送

由于良好的生物相容性和多功能性，脂質(zhì)體作為有效的藥物遞送納米系統(tǒng)被廣泛用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域．然而，脂質(zhì)體的應(yīng)用由于其存儲穩(wěn)定性差，藥物提前泄漏和藥物釋放不受控制等缺點而受到限制[1].功能化的脂質(zhì)體磷脂雙分子層膜可對各種物理和化學刺激做出響應(yīng)，包括溫度、pH值和離子等，可以有效解決藥物在體內(nèi)循環(huán)過程中提前泄露的問題[2-3]．

隨著納米載體的發(fā)展，納米凝膠由于其良好的生物相容性、機械穩(wěn)定性以及易修飾性受到研究者們的廣泛關(guān)注[4-6]．尤其是改性后具有刺激響應(yīng)性的納米凝膠，能夠響應(yīng)周圍環(huán)境如pH、溫度的變化，實現(xiàn)藥物的控制釋放，從而提高對癌癥的治療效果．

谷胱甘肽(GSH)作為體內(nèi)重要的還原劑，可以破壞二硫鍵．研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞與正常細胞的微環(huán)境有顯著差異，腫瘤細胞內(nèi)的GSH濃度為0.5～10,mmol/L，遠遠高于腫瘤外的GSH濃度(2～20,μmol/L)．同時，腫瘤細胞周圍組織液的pH值(6.8～7.2)及腫瘤細胞內(nèi)的pH值(4～6)與正常細胞內(nèi)外的pH值(7.4)也存在一定的差異．基于腫瘤細胞相比于正常細胞而顯示出來的特異性，構(gòu)建一種可響應(yīng)腫瘤微環(huán)境特異性刺激的多敏感納米藥物遞送系統(tǒng)是提高抗癌藥物遞送效率的關(guān)鍵[7]．

因此，本文構(gòu)建了穩(wěn)定、高載藥量以及可響應(yīng)腫瘤微環(huán)境刺激的載藥納米凝膠(DOX@pH/R-lipogels)載體．使用羧基化膽固醇和蛋黃卵磷脂制備了pH敏感的脂質(zhì)體膜，接著以脂質(zhì)體膜為聚合模板，丙烯酰胺為單體，還原敏感的胱氨酸甲基丙烯酸酯(CDA)為交聯(lián)劑，通過模板原位聚合方法[8-9]設(shè)計出一種新型的pH和還原雙敏感的納米藥物遞送載體pH/R-lipogels．模型藥物阿霉素鹽酸鹽(DOX)通過主動載藥的方式負載到納米載體中[10-11]．本實驗對pH/R-lipogels的水合粒徑及形貌進行表征，研究不同刺激條件對pH/R-lipogels粒徑的影響．同時探究了在不同條件下藥物釋放行為的變化．通過體外溶血實驗探究pH/R-lipogels的血液相容性，并評價細胞對pH/R-lipogels的攝取能力及pH/R-lipogels的體外細胞毒性．

1?實?驗

1.1?實驗主要材料

阿霉素鹽酸鹽(DOX，99%,)、谷胱甘肽(GSH，99%,)、核染料(Hoechst 33342，BR)、蛋黃卵磷脂(egg PC，BR)和聚乙二醇辛基苯基醚(TX100，BR)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽(V-50，98%,)、丙烯酰胺(AAM，99%,)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，98%,)、膽固醇(Chol，95%,)、膽固醇琥珀酸單酯(CHEMS，97%,)和抗壞血酸(99%,)均購自天津希恩思生化科技有限公司；氯化鈉、氯化鉀、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、檸檬酸和三氯甲烷均為分析純試劑，購自利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學有限公司．胱氨酸二甲基丙烯酸酯(CDA)詳細的制備方法見文獻[12]．

1.2?脂質(zhì)體納米凝膠的制備

pH和還原雙敏感脂質(zhì)體納米凝膠的制備方法如下：40,μmol的egg PC和13,μmol的CHEMS通過2,mL三氯甲烷溶解在500,mL的梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去得到一層無色透亮的薄膜，放入真空干燥箱中12,h使溶劑完全揮發(fā)．將得到的干燥脂質(zhì)體膜用5,mL水凝膠預(yù)聚物水溶液(500,mg單體AAM，50,mg交聯(lián)劑CDA，5,mg引發(fā)劑V-50，260,mmol硫酸銨)水化．通過手搖法使脂質(zhì)體膜從內(nèi)壁脫落溶解到預(yù)聚水溶液中，在冰水浴下將樣品置于細胞粉碎儀探頭下400,W超聲5,min，形成由脂質(zhì)體囊泡和納米凝膠預(yù)聚物水溶液組成的混合溶液．接著在脂質(zhì)體外加入可阻止脂質(zhì)體囊泡外部聚合的阻聚劑抗壞血酸50,mg，抽真空后通入氮氣，重復(fù)3次．將在氮氣保護下的密封反應(yīng)裝置置于45,℃水浴鍋中反應(yīng)70,min，并將反應(yīng)后的溶液置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量8,000)中透析去除未反應(yīng)的單體、交聯(lián)劑及硫酸銨．先后用200,nm、100,nm孔徑大小的脂質(zhì)體擠出器擠出透析所得溶液，得到粒徑分布良好的雙敏感脂質(zhì)體納米凝膠溶液，定義為pH/R-lipogels.

脂質(zhì)體膜包覆的還原敏感納米凝膠(R-lipogels)的制備方法同上，只是將具有pH敏感性的膽固醇琥珀酸單酯(CHEMS)換成普通膽固醇(Chol)；pH敏感脂質(zhì)體膜包覆的無敏感納米凝膠(pH-lipogels)是在制備過程中，將帶有二硫鍵的交聯(lián)劑CDA換成普通交聯(lián)劑MBA所制得的；在雙敏感納米凝膠的制備過程中，將CHEMS換成普通的Chol、將CDA換成MBA，制得非敏感脂質(zhì)體納米凝膠(N-lipogels)．

1.3?pH/R-lipogels粒徑及形貌表征

本實驗采用激光粒度儀來測定pH/R-lipogels的粒徑及其粒徑分布．每個樣品重復(fù)測試3次，測試時間為2,min，取3次測試平均值做為最終測試結(jié)果．利用透射電子顯微鏡觀察pH/R-lipogels的形貌，制樣方法如下：將待測溶液滴加到碳膜銅網(wǎng)上，室溫下于超凈臺放置24,h，至水分自然揮發(fā)后，通過透射電鏡觀察．

1.4?DOX@pH/R-lipogels的制備

載藥脂質(zhì)體納米凝膠DOX@pH/R-lipogels利用硫酸銨主動載藥的方法來制備[11]，具體步驟如下：稱取一定量的DOX溶解于超純水中配成質(zhì)量濃度為10,mg/mL的溶液，以阿霉素與卵磷脂的質(zhì)量比為0.167的比例將DOX加入到上述制得的雙敏感pH/R-Lipogels溶液中，然后將混合溶液放入60,℃水浴鍋中共培育1,h，之后透析24,h去除未包封的藥物，得到負載DOX的脂質(zhì)體納米凝膠DOX@pH/R-lipogels，整個過程需要避光處理．通過紫外-可見光分光光度儀測定波長在480,nm處DOX的吸光度，結(jié)合鹽酸阿霉素的標準曲線，用總投藥量減去透析液中藥物量即為包封藥物量，包封率(%)和載藥量(%)計算式分別為

???(1)

???(2)

1.5?藥物釋放行為研究

DOX@pH/R-lipogels在37,℃下置于不同的緩沖液中進行藥物釋放研究：①pH 7.4的PBS溶液；②GSH濃度為10,mmol/L，pH 7.4的PBS溶液；③pH 5.0的PBS溶液；④GSH濃度為10,mmol/L，pH 5.0的PBS溶液．取2,mL的DOX@pH/R-lipogels溶液密封到透析袋并置于10,mL緩沖溶液中，每組3個平行樣，然后放入37,℃的恒溫振蕩器中(80,r/min)進行體外藥物釋放實驗．在規(guī)定的時間間隔點，取出3,mL釋放液并補加3,mL新鮮的緩沖液．

使用紫外-可見光分光光度儀，結(jié)合鹽酸阿霉素的標準曲線，測試取出的釋放液中阿霉素的含量．累積藥物釋放量計算式為

???(3)

1.6?體外細胞攝取

以4T1乳腺癌細胞為細胞模型，將細胞以2×105細胞/孔的密度在6孔板中種植并以37,℃培養(yǎng)24,h．然后將細胞與游離DOX和載有DOX的脂質(zhì)體納米凝膠(DOX@R-lipogels、DOX@pH-lipogels、DOX@pH/R-lipogels和DOX@N-lipogels)以一定的DOX質(zhì)量濃度(10,μg/mL)共培育4,h．之后，除去培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細胞3次．細胞核用Hoechst 33342染色．采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細胞的攝取情況．

1.7?體外細胞毒

以4T1乳腺癌細胞為腫瘤細胞模型，采用MTT法表征脂質(zhì)體納米凝膠的體外細胞毒性．4T1細胞被接種在96孔板中，密度為8,000細胞/孔，在DMEM培養(yǎng)基中，將細胞置于37,℃、5%, CO2的條件下培養(yǎng)24,h．培養(yǎng)完成后，移除適量培養(yǎng)基，分別添加100,μL不同質(zhì)量濃度的空白脂質(zhì)體納米凝膠溶液、游離DOX和幾種負載DOX的脂質(zhì)體納米凝膠溶液(根據(jù)DOX質(zhì)量濃度的不同分為多組)，在上述條件下培養(yǎng)48,h之后，移除納米凝膠培養(yǎng)液，添加100,μL DMEM培養(yǎng)基和20,μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4,h．之后完全移除培養(yǎng)基，每孔加入150,μL的DMSO，避光振蕩待紫色結(jié)晶全部溶解，振蕩培養(yǎng)板使其均勻染色．使用酶標儀檢測波長在570,nm處的吸光度，計算細胞的存活率．

1.8?體外溶血實驗

室溫下，取1mL新鮮的血液利用離心機以2,000,r/min的轉(zhuǎn)速離心5,min，移除上層清液，然后用無菌的PBS溶液沖洗，再離心，重復(fù)4次．將紅細胞(RBC)懸浮于PBS中并添加無藥脂質(zhì)體納米凝膠使載體質(zhì)量濃度達到400,μg/mL．用PBS和純水處理RBC分別用作陰性和陽性對照．將100,μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，在波長573,nm處測定吸光度值．細胞的溶血率(%)計算式為

???(4)

2?實驗結(jié)果與討論

2.1?pH/R-lipogels性能表征

使用激光粒度儀(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)對pH/R-lipogels進行表征．由圖1可知，pH/R-lipogels粒徑為(128±7.9)nm，PDI分布為0.150，通過電鏡圖片可知pH/R-lipogels呈球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為110,nm，說明pH/R-lipogels形貌規(guī)則，粒徑分布良好．

圖1?pH/R-lipogels的粒徑分布和透射電鏡圖

圖2 DOX@pH/R-lipogels在不同條件下的粒徑分布

2.2?DOX@pH/R-lipogels敏感性能表征

通過硫酸銨主動載藥技術(shù)，本文制備出高載藥量的DOX@pH/R-lipogels并采用激光粒度儀(DLS)對脂質(zhì)體納米凝膠的性能進行表征．如圖2所示，pH值為7.4時DOX@pH/R-lipogels的粒徑為(140±5.0)nm，粒徑分布較窄；pH值為6.5時，DOX@pH/R-lipogels粒徑分布較寬，粒徑變大；當pH值為5.0時，粒徑分布更寬，而且出現(xiàn)了兩個峰，說明隨著pH值的降低，脂質(zhì)體膜孔隙變大，結(jié)構(gòu)也變得松散、不穩(wěn)定．上述現(xiàn)象表明DOX@pH/R-lipogels具有pH敏感性．在pH值為7.4的條件下，加入GSH后，粒徑略微變大；當加入TX-100溶液后，觀察到兩個粒徑峰，一個是表面活性劑TX100將脂質(zhì)體膜去除后的10,nm左右的膠束峰，另一個是100,nm左右很小的納米凝膠峰，說明DOX@pH/R-lipogels納米凝膠內(nèi)核具有還原響應(yīng)性．

2.3?DOX@pH/R-lipogels體外藥物釋放

首先通過主動載藥方法將DOX藥物包裹到pH/R-lipogels中，藥物包封率為99.67%(質(zhì)量分數(shù))，載藥量為28.94%(質(zhì)量分數(shù))．接著探究了DOX@ pH/R-lipogels在pH和GSH還原條件下雙重刺激的藥物釋放行為，如圖3所示．在pH 7.4的PBS溶液中，24,h藥物累積釋放量為28.48%，在同樣的pH條件下，GSH加入明顯加快了藥物釋放，24,h藥物累積釋放量可達61.7%,，這是由于GSH的加入破壞了脂質(zhì)體內(nèi)部還原敏感的納米凝膠，使得存儲于納米凝膠內(nèi)部的DOX從脂質(zhì)體擴散出來．當釋放介質(zhì)的pH值為5.0時，DOX的24,h累積釋放量為48.7%，這是因為低pH條件下脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分藥物也會從脂質(zhì)體的增大的孔隙中擴散出來；在低pH和GSH的雙重刺激下，DOX在24,h的累積釋放量高達99%,，藥物幾乎完全釋放．綜上所述，本實驗構(gòu)建的pH/R-lipogels具有顯著的pH和還原雙重響應(yīng)性能，可實現(xiàn)藥物在腫瘤細胞內(nèi)的有效遞送．

圖3 DOX@pH/R-lipogels在不同條件下DOX釋放曲線

2.4?細胞攝取

有效的細胞攝取是提高抗癌藥物治療效果的先決條件．為了證明pH和還原雙敏感的載體pH/R-lipogels可以在腫瘤細胞特殊的微環(huán)境下快速釋放藥物，本實驗利用共聚焦顯微鏡觀察了負載DOX的4種載體DOX@pH/R-lipogels、DOX@R-lipogels、DOX@pH-lipogels和DOX@N-lipogels與4T1細胞共培育一段時間之后的藥物攝取情況．Hoechst 33342被用于細胞核染色使其發(fā)出藍色熒光，紅色熒光是DOX自身的熒光，通過熒光的疊加可以觀察DOX被細胞攝取的情況．如圖4所示，DOX@pH/R-lipogels在4T1細胞核周圍的紅色熒光強度最強，游離DOX和單敏感的DOX@R-lipogels、DOX@pH-lipogels熒光強度較弱，而無敏感的DOX@N-lipogels培養(yǎng)的細胞熒光強度最弱．這些結(jié)果表明，DOX@pH/R-lipogels在被細胞胞吞后，由于其內(nèi)核和脂質(zhì)體膜的雙重敏感，導(dǎo)致納米凝膠內(nèi)核破壞、脂質(zhì)體膜孔隙變大，使DOX能夠有效地、快速地釋放．如圖所示，DOX@pH/R-lipogels中DOX在細胞核周圍的分布明顯高于其他單敏感納米凝膠組和靠小分子擴散進入細胞的游離阿霉素．綜上所述，具有pH和GSH雙重敏感的載藥脂質(zhì)體納米凝膠DOX@pH/R-lipogels能夠?qū)崿F(xiàn)細胞內(nèi)的快速釋放．尤其相比于單敏感的載藥納米凝膠，DOX@pH/R-lipogels的內(nèi)核和外層脂質(zhì)體膜都可對腫瘤細胞的微環(huán)境做出響應(yīng)，在胞內(nèi)藥物釋放時呈現(xiàn)出更好的效果．

圖4 4T1細胞對游離DOX和負載DOX藥物的不同脂質(zhì)體納米凝膠載體攝取共聚焦顯微鏡圖片(標尺：20,μm)

2.5?體外細胞毒性

本實驗采用MTT方法測定載體的體外細胞毒性，選用細胞為4T1細胞．如圖5(a)所示．當4種空白脂質(zhì)體納米凝膠的最高質(zhì)量濃度為500,μg/mL時，細胞存活率仍都在85%,以上，表明這些載體有很好的生物相容性．

如圖5(b)所示，隨著DOX質(zhì)量濃度的增加，細胞存活率均顯示出降低的趨勢．幾種載藥脂質(zhì)體納米凝膠顯示出的藥效與DOX基本一致，當DOX質(zhì)量濃度過高時，雙敏感載藥脂質(zhì)體納米凝膠DOX@pH/R-lipogels表現(xiàn)出更強的細胞毒性．

圖5 不同質(zhì)量濃度空白脂質(zhì)體納米凝膠和載藥脂質(zhì)體納米凝膠對4T1細胞毒性的研究

2.6?溶血試驗的研究

納米材料的血液相容性是評價其生物相容性的重要標準．PBS作為陰性對照組，水作為陽性對照組，pH/R-lipogels作為實驗室組進行實驗．如圖6所示，在37,℃下pH/R-lipogels與RBC在PBS溶液中孵育4,h后沒有表現(xiàn)出明顯的溶血性，并通過計算得到pH/R-lipogels的溶血率低于5％,．以上結(jié)果表明pH/R-lipogels載體有很好的生物相容性，可用于后期的體內(nèi)實驗．

圖6 pH/R-lipogels的溶血實驗結(jié)果(水作為陽性對照，PBS作為陰性對照)

3?結(jié)?語

本文通過原位模板聚合方法成功制備出pH和還原雙敏感脂質(zhì)體納米凝膠pH/R-lipogels，通過DLS和TEM對其粒徑分布和形貌進行了表征，結(jié)果顯示pH/R-lipogels粒徑分布良好，形貌呈球形結(jié)構(gòu)．結(jié)合主動載藥技術(shù)，實現(xiàn)了載體對藥物的高負載量．體外藥物釋放行為表明DOX@pH/R-lipogels能夠快速響應(yīng)pH和還原刺激并實現(xiàn)藥物完全釋放．通過體外細胞攝取實驗數(shù)據(jù)可知，雙敏感pH/R-lipogels載體相比單敏感(R-lipogels和pH-lipogels)載體和游離DOX可實現(xiàn)抗癌藥物DOX在細胞中更多的分布．體外細胞毒性和溶血實驗表明pH/R-lipogels有很好的生物安全性和相容性．以上結(jié)果說明pH/R-lipogels作為一種智能的藥物遞送載體具有十分廣闊的應(yīng)用前景．

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(責任編輯：田?軍)

Construction and Properties of Dual-Responsive Lipogels

Dong Anjie1, 2，Yu Lixia1，Ma Jinfeng1，Deng Liandong1，Zhang Jianhua1, 3

(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China； 2. Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin)，Tianjin 300072，China； 3. Tianjin Key Laboratory of Membrane Science and Desalination Technology， Tianjin University，Tianjin 300072，China)

As anticancer drugs are difficult to control and release precisely at tumor sites，a dual-responsive pH/R-lipogel carrier was designed and prepared in this study. The pH/R-lipogels comprising pH-sensitive liposome membranes and redox-sensitive 3D cross-linked network cores were constructed through in-situ template polymerization. The particle size distribution and morphology of pH/R-lipogels were studied by a laser particle sizer and transmission electron microscope. The results indicated the narrow size distribution and regular spherical structure of the pH/R-lipogels feature. The in vitro drug-release experiments showed that the doxorubicin hydrochloride pH/R-lipogels (DOX@pH/R-lipogels) can rapidly respond to changes in pH and GSH concentrations and improve the efficiency ofDOXrelease. The in vitro cell experiments showed that the DOX@pH/R-lipogels that is stimulated by the microenvironment of tumor cells can effectively release DOX and promote 4T1 cell apoptosis. These results indicate that the pH/R-lipogels have a remarkable potential in drug delivery systems and provide a foundation for the study of membrane materials.

liposome；nanogels；dual-responsive；drug delivery

10.11784/tdxbz201804011

R945

A

0493-2137(2019)03-0225-06

2018-04-04；

2018-04-27.

董岸杰（1964—??），女，博士，教授，ajdong@tju.edu.cn.

張建華，jhuazhang@tju.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(31470925，31671021，31470963)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃資助項目(15JCQNJC03000).

the National Natural Science Foundation of China(No.31470925，No.31671021，No.31470963)，the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.15JCQNJC03000).