王婉愉，李姣，王霄凱，張曉峰，呂全軍

（鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，河南鄭州450001）

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬被子植物門（Angiospermae），百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學名“蒙古韭”，主要生長在內蒙古、青海、甘肅、新疆等無污染的沙漠地區(qū)，是一種極具特色的野生蔬菜[1]。沙蔥口感鮮嫩，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是草原人們喜愛的天然佳蔬，享有“大漠野菜”、“草原佳蔬”等美譽[2]。據(jù)蒙藥典記載：沙蔥具有降血壓、降血脂、開胃消食、緩解口膩等功效[3]。近年來，蔥屬植物作為低毒植物藥，其生理保健功能已得到廣泛關注，具有預防心血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、改善糖代謝等作用，具有很大的潛在開發(fā)價值[4]。沙蔥作為草原的重要野生植物，以其獨特的風味、豐富的營養(yǎng)價值、并且綠色無毒副作用越來越受到人們的青睞[5]。

目前沙蔥的相關研究多集中于對其主要活性成分的提取、分離鑒定和對動物機能的改善方面，關于α-葡萄糖苷酶抑制活性和胰脂肪酶抑制活性的研究鮮有報道。本研究以沙蔥為原料，通過測定沙蔥水提液的總黃酮含量、DPPH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶活性和胰脂肪酶活性的抑制作用，來探討沙蔥的體外抗氧化以及其在調節(jié)糖脂代謝方面的潛在功效，以期為沙蔥的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮沙蔥：于2017年9月20日購于內蒙古阿拉善，經(jīng)鄭州大學藥學院中藥教研室教授鑒定為百合科植物沙蔥（Allium mongolicum Regel）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-葡萄糖苷酶（酶活力≥10U/mg）、胰脂肪酶（酶活力 30 U/mg～90 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-His-Leu hydratepowder，HHL）：美國 Sigma 公司；奎諾二甲基丙烯酸酯（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox）、Tris-HCL、槲皮素：上海阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-18B冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；10-2BS電熱鼓風干燥箱：天津市華北實驗儀器有限公司；RE-2000旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge 5418高速離心機：艾本德中國有限公司；QL-901渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Spectra Max M2e多功能微孔板讀數(shù)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙蔥樣品的處理

沙蔥用純水清洗后瀝干水分，放置于真空冷凍干燥機中進行干燥。取干燥樣品粉碎成粉，過60目篩，用四氯甲烷[質量體積比=1 ∶10（g/mL）]脫脂 24 h，抽濾后置于通風處晾干。稱取10 g脫脂干粉，加入100 mL純水，常溫下浸提24 h，抽濾，濾渣重復上述步驟2次，合并2次提取的濾液，于循環(huán)水式蒸發(fā)儀濃縮至液體剩余20 mL，相當于10 g脫脂干粉最終溶解在20 mL的溶劑中，提取液濃度即為500 mg/mL。作為待測提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

吸附過程從本質上說是一個濃縮富集工藝。吸附、脫附是依靠吸附劑的物理和化學吸附作用，把廢氣中的有機物吸附下來，從而達到凈化廢氣的目的。吸附劑進行吸附只是把有機物吸附下來，并沒有把有機物真正轉化為無害的物質，并且吸附到一定程度會達到飽和，所以通常必須進行脫附再生。脫附的方法有飽和蒸汽脫附溶劑回收法、熱空氣脫附溶劑回收法和催化燃燒熱空氣脫附法。

1.3.2 黃酮含量的測定

采用改進的Dowd[11]方法測定總黃酮含量（total flavonoid content，TFC），以槲皮素為標準品繪制標準曲線。取100 μL待測提取液，梯度稀釋，加入等量2%AlCl3甲醇溶液，于25℃靜置10 min。于415 nm波長處測定其吸光度。提取液的黃酮含量以槲皮素當量（quercetin equivalent，QE）為標準進行定量，最終的黃酮含量以每克干粉所含的槲皮素當量表示（mgQE/gDW）。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定[12]

于96微孔板中加入100 μL不同濃度的待測提取液，隨后加入100 μL 0.208 mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫下避光靜置40 min后于517 nm處測定吸光度。以不同濃度的Trolox甲醇溶液為標準對照，不同樣品相應DPPH自由基清除能力表示為mg Trolox equivalent（TE）/g DW，即 Trolox等價抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。樣品對DPPH自由基的清除率計算如（公式1）所示：

式中：Ac為對照組（100 μL DPPH 溶液+100 μL 甲醇溶液）在517 nm處的吸光度；Ai為100 μL樣品液+100 μL DPPH溶液在517 nm處的吸光度；Aj為100 μL樣品液+100 μL甲醇溶液在517 nm處的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定[13]

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP），pNP在堿性條件下 405 nm 波長處有最大吸收值，利用酶標儀測定其濃度，從而可以檢測加入樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。α-葡萄糖苷酶溶液與PNPG底物溶液均由0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=6.8）。根據(jù) α-葡萄糖苷酶活性抑制模型：在96孔板中加入8 μL待測提取液，梯度稀釋，隨后加入112 μL 0.1 mol/L PBS與 20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃恒溫條件下放置15 min后加入20 μL 2.5 mmol/L PNPG底物溶液，37℃恒溫反應15 min。最后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，于405 nm波長處測定吸光度（A樣），每個樣品平行測定3次。同時設定相同條件下以磷酸鉀緩沖液替代α-葡萄糖苷酶溶液的樣品空白組（A樣空），不加樣品的陰性對照（A陰），不加樣品、酶的空白對照組（A空）。水提液α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計算方法如（公式2）所示。并求出相應的IC50值。

1.3.5 胰脂肪酶抑制活性的測定[14]

胰脂肪酶水解對硝基苯基月桂酸酯（pNP laurate）產(chǎn)生4-硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP），PNP 在水溶液中顯黃色，在405nm處有最大吸收峰。通過測定405nm處PNP的量來評定樣品的脂肪酶抑制活性。底物溶液與酶溶液的配制：稱取0.08 g對硝基苯基月桂酸酯，溶于100 mL 5 mmol/L乙酸鈉溶液（pH=5.0，含1%曲拉通x-100），配制成8 g/100 mL的pNP laurate溶液，使用前放入沸水中溶解1 min，放置到室溫；胰脂肪酶用蒸餾水溶解配成 10 mg/mL，4℃，13 000 r/min，離心5 min后取上清液。具體試驗操作步驟為：在1.5 mL離心管中加入50 μL待測提取液，梯度稀釋，隨后加入150 μL 10 mg/mL 胰脂肪酶液與 350 μL 0.1 mol/L Tris-HCL緩沖液（pH=8.2），于 37℃預熱 10 min，隨后加入450 μL底物溶液開始反應，于37℃反應2 h。反應結束后，16 000 r/min離心3 min，取上清液加入96孔板，于405 nm處測定吸光值（A樣），每個樣品平行測定3次。同時設定相同條件下以Tris-HCL緩沖液替代胰脂肪酶溶液的樣品空白組（A樣空），不加樣品的陰性對照（A陰），不加樣品、酶的空白對照組（A空）。水提液胰脂肪酶活性的抑制率計算方法如（公式3）所示。并求出相應的IC50值。

1.3.6 觀察指標及評判標準

本研究DPPH自由基清除試驗與酶活性抑制試驗中以IC50值即自由基（酶活性）被清除（抑制）一半時所需的樣品質量濃度為觀察指標。計算方法：以自由基清除率（酶活性抑制率）為縱坐標、樣品液的質量濃度為橫坐標作線性回歸，從回歸曲線的置信限制中讀出概率為0.50的估算濃度即為IC50值。IC50值指清除率（抑制率）達50%時所需的樣品質量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準誤差表示（±SD）。

2 結果與分析

2.1 沙蔥水提液中的黃酮含量

以槲皮素的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制的標準曲線如圖1所示。

圖1 槲皮素標準曲線Fig.1 Quercetin standard curve for TPC analysis

由圖1可知，標準曲線方程為y=0.009 9x+0.073 8（R2=0.999），說明槲皮素在 0～200 μg/mL質量濃度范圍內與吸光度具有良好的線性關系；測定得到沙蔥水提液中的黃酮含量為4.02 mg QE/g DW。

2.2 沙蔥水提液對DPPH自由基的清除能力

Trolox標準曲線如圖2所示。

圖2 Trolox標準曲線Fig.2 The standard curve of Trolox

由圖2可見，以Trolox標準溶液的質量濃度為橫坐標，對DPPH自由基的清除率為縱坐標，標準曲線方程為 y=0.597 1x+22.164（R2=0.999），說明 Trolox 標準溶液在0～150 μg/mL質量濃度范圍內與其對DPPH自由基的清除率具有良好的線性關系。測定得到的沙蔥水提物的Trolox等價抗氧化能力為51.82 mg Trolox/g。

沙蔥水提液在不同濃度下的DPPH自由基清除活性如表1所示。

沙蔥水提液對DPPH自由基清除作用的IC50擬合曲線如圖3所示。

圖3 沙蔥水提液的DPPH自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on DPPH radicals

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，根據(jù)自由基的清除情況可評價物質的抗氧化能力，DPPH·乙醇溶液呈特征性的紫紅色，加入受試物后，其顏色會逐漸變淺，因此在517 nm處可以動態(tài)的檢測其對DPPH·的清除效果[15]。由表1可知，沙蔥水提液質量濃度在0.39 mg/mL～3.13 mg/mL時，其清除DPPH自由基的能力隨著質量濃度的增大而增大，說明其在此濃度范圍內自由基清除能力與水提液濃度有明顯的相關性，并且各濃度的清除率之間具有顯著性差異（P＜0.05）；當待測液濃度大于3.13 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率的能力趨于平緩，且組間差異不顯著（P＜0.05），當質量濃度為 12.50 mg/mL 時，其對DPPH自由基的清除率達到最大（92.95±0.84）%，由圖3得出沙蔥水提液清除DPPH自由基的IC50值為0.867 mg/mL；TEAC值為51.82 mg Trolox/g，說明每克沙蔥干物質對DPPH自由基的抑制功效與51.82 mg Trolox的清除功效相當。本試驗所得數(shù)據(jù)雖然低于人工合成的常用抗氧化劑Trolox，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.3 沙蔥水提液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一組通過延緩糖的消化以降低餐后高血糖狀況的口服降糖藥，其作用特點是在糖消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖[16]。沙蔥水提液在不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表2所示。

表2 沙蔥水提液在不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 The α-glucosidase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙蔥水提液對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50擬合曲線如圖4所示。

圖4 沙蔥水提液對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract against α-glucosidase

從表2與圖4可以看出，沙蔥水提液質量濃度在62.50 mg/mL～500.00 mg/mL時，其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著質量濃度的增大而增大，說明其在此濃度范圍內對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與提取物濃度有明顯的相關性，并且各濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之間的差異具有顯著性（P＜0.05）；當質量濃度為500 mg/mL時，其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率達到（70.50±1.53）%，抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值為326.29 mg/mL。說明沙蔥對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

2.4 沙蔥對胰脂肪酶的抑制活性

胰脂肪酶是人類消化脂肪的主要酶，應用胰脂肪酶抑制劑可有效抑制胰脂肪酶對脂肪的分解催化作用，達到減少脂肪吸收、控制和治療肥胖的目的[17]。沙蔥水提液在不同濃度下的胰脂肪酶抑制活性如表3所示。

表3 沙蔥水提液在不同濃度下的胰脂肪酶抑制活性Table 3 The pancreatic lipase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙蔥水提液對胰脂肪酶活性抑制作用的IC50擬合曲線如圖5所示。

從表3可以看出，沙蔥水提液對胰脂肪酶活性具有很好的抑制作用，當待測液質量濃度為62.50 mg/mL時，對胰脂肪酶活性的抑制率較低，為（17.70±1.17）%，但隨著質量濃度的增大，其抑制活性逐漸增強，4組數(shù)據(jù)比較具有顯著性（P＜0.05）；當質量濃度為500 mg/mL，其對胰脂肪酶活性的抑制率就達到較高的水平，為（90.89±1.82）%，說明其對酶活性的抑制呈現(xiàn)出質量濃度依賴性。由圖5的擬合曲線可以得出沙蔥水提液胰脂肪酶抑制活性的IC50值為179.41 mg/mL。

圖5 沙蔥水提液對胰脂肪酶的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on pancreatic lipase

3 討論

本研究以純水對脫脂沙蔥干粉進行提取，三氯化鋁比色法測定得到其總黃酮含量為4.02 mg QE/g DW。此數(shù)據(jù)結果與薩茹麗等所做的研究結果大致相符[18]。黃酮的基本化學結構是由兩個苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）以雜環(huán)吡喃酮環(huán)鏈接的15碳骨架，由于其苯環(huán)上的羥基極易失去氫電子，可作為良好的電子供體而發(fā)揮抗氧化功能[19]。沙蔥待測液對DPPH·清除能力的IC50值為0.883 mg/mL。一般認為如果某種物質的IC50值小于10 mg/mL，那么該物質就具備抗氧化能力[20]。故可初步判定沙蔥具有良好的抗氧化能力。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內各種α-葡萄糖苷酶，減慢淀粉類分解為葡萄糖的速率，可減緩腸道內葡萄糖的吸收，降低餐后血糖水平的升高，從而減少高血糖對胰腺的刺激，提高胰島素敏感性，有效預防并改善糖代謝相關疾病的發(fā)生與發(fā)展[21]。市面上常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如已廣泛應用于臨床的阿卡波糖、伏格列波糖等對餐后高血糖都有較強的調節(jié)作用，但長期服用可能會對人體產(chǎn)生一定的副作用[22]。研究表明，多種蔥屬植物在降糖方面都有功效，如大蒜、洋蔥等，在α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有較強的功能[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)沙蔥具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且隨著質量濃度的增高，其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐漸增強，這為從天然產(chǎn)物中獲取α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了新思路。

脂肪是產(chǎn)能系數(shù)最高的膳食營養(yǎng)素，而膳食脂肪只有經(jīng)過胰脂肪酶消化分解才能被人體吸收，對胰脂肪酶抑制活性的測定是評判天然產(chǎn)物作為抗肥胖藥物潛在功效中研究最廣泛的機制之一[24]。已有研究表明蔥屬植物中洋蔥等在降脂減肥方面具有很好功效[24]。本研究結果顯示，當沙蔥待測液濃度為500 mg/mL時，對胰脂肪酶活性的抑制率達到90.89%，說明其對胰脂肪酶具有很好的酶抑制作用，鑒于胰脂肪酶活性與肥胖之間的密切聯(lián)系，沙蔥在抑制脂肪分解、降低能量攝入和調節(jié)脂代謝等方面可能具有潛在功效。

4 結論

本研究測定得到沙蔥水提液中含有較多的黃酮類化合物，自由基清除試驗說明沙蔥具有良好的體外抗氧化能力，并且其對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用較顯著。α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶分別負責體內脂肪和糖類的水解，因此，沙蔥作為天然植物來源的α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制劑，具有調節(jié)體內糖脂代謝和進一步開發(fā)為糖尿病和肥胖的治療劑或輔助劑的潛力，對其功效成分和生理功能的研究有較好的理論和實踐價值。