張典，陳金玉，張坤生，任云霞，尚坤，吳鵬

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

貯藏期間的脂肪氧化和蛋白氧化是影響肉及肉制品品質的重要因素，其中脂肪氧化易導致有害物質和腐敗臭味的產生[1]，同時氧化產生的系列產物會給貯藏期間肉品的色澤、風味、組織結構以及營養(yǎng)價值帶來不利的影響。目前，防止肉制品中脂肪和蛋白質氧化的方法很多，其中添加抗氧化劑是最有效的辦法之一。近年來，人工合成抗氧化劑對人體具有不利影響相繼被報道[2]，因此，在肉及肉制品中使用天然抗氧化劑成為關注和研究的熱點。

植物多酚作為一類廣泛存在于植物體內的具有抗氧化活性的天然多酚類化合物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉和果中，在自然界的儲量非常豐富[3]。我國香蕉產量居世界前列，但其產品主要以鮮品形式銷售食用，而占香蕉全果質量40%的香蕉皮等隨意丟棄，既浪費資源又污染環(huán)境。有研究顯示，香蕉皮中不僅含有大量的營養(yǎng)成分，而且含有多種抗氧化活性成分，多酚物質就是其中之一，因而香蕉皮作為天然抗氧化劑的來源具有較大的開發(fā)和利用價值[4-5]。目前，關于香蕉皮多酚提取物對肉丸等肉制品貯藏品質的影響尚缺乏研究。

因此，本文在響應面法優(yōu)化香蕉皮多酚提取工藝的基礎上，測定香蕉皮多酚提取物的抗氧化能力，研究不同濃度香蕉皮多酚對肉丸貯藏品質的影響，旨在為香蕉皮的深加工和利用、延緩和降低肉制品貯藏品質劣變，及延長肉制品貯藏期提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉（新鮮、無黑斑）、豬肉、食鹽：天津市紅橋區(qū)華潤萬家超市西青道店；沒食子酸：上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SHB-Ⅲ型真空循環(huán)水泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；U-5100比例光束分光光度計：日立高新技術公司；A－vanti J-E高效離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；Hunter Lab色差儀：美國Hunter Lab公司；PEN3便攜式電子鼻：德國AIRSENSE公司；TA.XT plus物性測試儀：英國Stable Micro Systems公司；AquaLab水分活度測定儀：美國DECAGON公司。

1.2 方法

1.2.1 預處理及香蕉皮多酚的提取

香蕉剝離果肉后將香蕉皮清洗干凈，然后將香蕉皮進行切分，稱取一定量的香蕉皮在沸水中熱燙3min～5 min進行滅酶，之后用一定體積的乙醇水溶液在一定溫度下浸提一定時間，利用真空循環(huán)水泵濾掉雜質，收集濾液，得到香蕉皮多酚提取液。

1.2.2 香蕉皮中多酚含量的測定

采用福林酚法[6]測定多酚含量，沒食子酸作為標準樣品。

1.2.3 香蕉皮多酚提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗

香蕉皮多酚在提取過程中，影響提取率的主要因素為乙醇濃度、液料比、浸提時間和浸提溫度。分別考察乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）、液料比[1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1（mL/g）]、浸提時間（1、1.5、2、2.5、3.0、3.5 h）和浸提溫度（20、35、50、65、80、95 ℃）對香蕉皮多酚提取率的影響。

1.2.3.2 響應面優(yōu)化試驗

根據單因素試驗結果，利用Box-behnken設計原理，以多酚得率為響應值，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為變量設計四因素三水平組合試驗，因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

采用F檢驗對試驗結果進行方差分析以評價模型的統計意義。

1.2.4 香蕉皮多酚抗氧化性能測定

根據響應面試驗結果提取得到香蕉皮多酚，將所得多酚進行抗氧化性能測定。

DPPH自由基清除能力測定：取2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液與2 mL不同處理后的蛋白溶液，混勻避光反應30 min后在517 nm處測吸光度值?？瞻捉M選用乙醇代替DPPH乙醇溶液；對照組為無水乙醇代替樣品與DPPH乙醇溶液反應。計算公式如下：

式中：A1為試驗組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對照組的吸光度。

還原能力測定：分別取不同處理后的蛋白溶液，加入2.5 mL pH6.6濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液和3.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 500 r/min離心10 min，取上清3 mL，再加入蒸餾水3 mL混合后加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻室溫靜置15 min，以等量去離子水代替樣品溶液調零，在700 nm波長下測定吸光度A[7-8]。

1.2.5 肉丸的制作及香蕉皮多酚的添加

基本配方為80%豬肉、18%蒸餾水（加冰）和2%食鹽。將豬肉切成小塊后分為四等份，分別作為不添加多酚的對照組（Con）、低濃度（1 mg/mL）香蕉皮多酚組（L）、中濃度（3 mg/mL）香蕉皮多酚組（M）和高濃度（5 mg/mL）香蕉皮多酚組（H），再用絞肉機斬拌攪碎，在斬拌的過程中添加食鹽、蒸餾水（加冰）和香蕉皮多酚。將肉糜制成大小相同的肉丸，放到沸水中煮制20 min后進行冷卻，放入自封袋中在4℃條件下保存，每3 d測定一次各項指標，即標記時間為0、3、6、9 d。

1.2.6 肉丸指標的測定

1.2.6.1 質構的測定

將待測肉丸切成直徑為1 cm厚度大約為1 cm的形狀置于測試平臺上固定好，室溫條件下利用TA-XT Plus型質構儀進行測定。測定模式設置為測前速率1 mm/s；測試速率1 mm/s；測后速率1 mm/s；下壓程度為40%；觸發(fā)類型為自動；引發(fā)力5 g；兩次壓縮之間停留的時間為5 s；數據采集速率為400 Hz；探頭型號P/50。每個樣品做3組平行。

1.2.6.2 色差的測定

待測肉丸的色差值采用全自動便攜式色差計進行測定，在測量色差之前先采用純白紙或者白色瓷磚校準，記錄 L*、a*、b*值，每個肉丸樣品測定 3 次，取其平均值。

1.2.6.3 pH值的測定

取不同待測肉丸各5 g，切碎后加50 mL蒸餾水，進行均質，靜置5 min，測定pH值，每組進行3次平行試驗，取平均值。

1.2.6.4 水分活度的測定

將待測肉丸樣品在室溫下切碎，鋪滿樣品盒底部，采用水分活度測定儀進行測定，每組進行3次平行試驗，取平均值。

1.2.6.5 感官評定

根據GB/T 2210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》對肉丸進行感官評定，其中10名感官評定員符合GB/T 2210-2008規(guī)定的要求。設置1分～10分分別對肉丸的顏色、風味、組織狀態(tài)、和總體可接受性進行評價打分，取平均值。

1.2.6.6 氣味的測定

稱取5 g待測肉丸均勻切碎后于燒杯中用保鮮膜密封，常溫下貯存30 min后采用便攜式電子鼻進行測定，且每種樣品檢測不低于3次?；緟翟O定為：平衡時間600 s；平衡溫度40℃；以潔凈干燥空氣為載氣，流速為1 000 mL/min；平衡溫度40℃；平衡時間600 s；注射體積 1 000 μL；注射速度 1 000 μL/min；數據采集時間120 s。

1.3 數據處理

通過Design Expert 8.0.6.1軟件設計響應面試驗，采用軟件Excel 2010、Origin8.0對數據進行統計分析并作圖，并通過SPSS 16.0對試驗數據進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線方程的建立

根據福林酚比色法得到的多酚含量標準曲線回歸方程為：Y=0.084 8X+0.040 1，R2=0.999，其中 Y 為吸光度，X為多酚濃度（mg/L）。

2.2 單因素試驗結果與分析

乙醇濃度、液料比、浸提時間、浸提溫度對多酚提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度、液料比、浸提時間、浸提溫度對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration，ratio of stuff to liquid，different time and temperature on extraction rate

由圖1（a）可知，隨乙醇濃度的增大香蕉皮多酚提取率先增大后降低，當濃度為60%時，提取率最大，達到30.71%，浸提效果最佳，原因是乙醇濃度越高，乙醇揮發(fā)性越大，對多酚的提取越不利。當液料比由1 ∶1（mL/g）增加到 5 ∶1（mL/g）時，提取率先增加后趨于穩(wěn)定，這是因為當液料比達到4∶1（mL/g）后溶劑用量趨于飽和，因而繼續(xù)增大液料比對提取率的影響不顯著[9]，考慮到液料比過高會增加濃縮時間和難度[10]，因此最佳液料比為 4 ∶1（mL/g）。由圖 1（b）可以看出，隨浸提時間的延長，提取率先上升后下降，當時間為2.0 h時提取率達到最大，出現上述趨勢的原因與香蕉皮多酚的不穩(wěn)定性有關，浸提時間越來對多酚的破壞越顯著。隨浸提溫度的升高，提取率呈先上升后降低的趨勢，當浸提溫度為80℃時，多酚提取率最高，這是由于溫度升高，分子運動加速，氫鍵更易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴散速度也加快，因而酚類物質更容易從原料中溶出，多酚提取率增大[9]，而當溫度過高時，多酚類物質容易發(fā)生氧化或降解反應，因而提取率降低。

2.3 響應面優(yōu)化結果與分析

根據單因素試驗結果，設計四因素三水平響應面試驗，以多酚提取率作為響應值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合。得二次多項式擬合方程為：Y=44.361 16+1.028 6A－0.363 78B+2.989 608C－2.499 36D －1.999 83AB －0.230 78AC －0.265 35AD+2.107 328BC+1.857 35BD+3.508 275CD －3.800 4A2－3.008 28B2－3.820 34C2－2.560 89D2。

回歸模型的顯著性檢驗和方差分析見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，該模型的F值為2.739，P＜0.05表明模型顯著。失擬項的F值為3.298，P=0.130 7＞0.05，故失擬項不顯著，說明模型選擇合適，該模型與實際情況擬合良好，可由此預測香蕉皮多酚提取的最佳條件。方差分析表明，浸提溫度和浸提時間對多酚提取率的影響顯著，從各變量顯著性檢驗P值的大小可以看出影響香蕉皮多酚提取率的各因素按大小排序依次為：浸提溫度＞浸提時間＞乙醇濃度＞液料比。乙醇濃度平方項、液料比平方項、浸提溫度平方項對多酚提取率的影響顯著。

2.4 驗證試驗結果

根據Box-Behnken試驗所得出的結果以及二次多項式回歸方程，再利用Design-Expert 8.0軟件獲得了磷酸化條件的最佳因素組合：乙醇濃度62.4%、液料比 3.68 ∶1（mL/g）、提取溫度 80.29 ℃、提取時間 1.7 h，此時預測的香蕉皮多酚提取率為45.33%。為檢驗模型預測的準確性，在此條件下進行3組平行驗證試驗，得到的香蕉皮多酚提取率為44.63%，顯然誤差值在±1%以內。由此可見，采用響應面法優(yōu)化香蕉皮多酚提取工藝是行之有效的。

2.5 香蕉皮多酚抗氧化性分析

不同濃度香蕉皮多酚的抗氧化能力見圖2。

圖2 不同濃度香蕉皮多酚的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of different concentrations of banana skin polyphenols

多酚是一類活性較強的抗氧化物質，具有供氫能力因而可有效清除自由基，同時還可與過氧化自由基結合使其成為穩(wěn)定的化合物，另外多酚還可以通過抑制氧化酶和絡合金屬離子等起到抗氧化作用[11]。本試驗研究了不同濃度的香蕉皮多酚對DPPH自由基清除能力和還原能力的影響。從圖2中可以看出，隨著香蕉皮多酚濃度的增大，DPPH自由基清除能力和還原能力均呈近似直線遞增，即抗氧化能力逐漸增強。有研究表明[9]，香蕉皮提取液中確認并檢測到的多酚達11種，且香蕉皮多酚的還原能力強于維生素C、叔丁基對苯二酚，還原能力隨濃度的增加而增強，這與本試驗測定的結果一致。

2.6 香蕉皮多酚對肉丸質構的影響

不同濃度香蕉皮多酚對肉丸質構的影響見圖3。

圖3 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸質構的影響Fig.3 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the texture of meatballs

不同處理肉丸的硬度變化如圖3（a）所示，硬度隨貯藏時間的延長大體呈現上升的趨勢。在第0天時，添加不同濃度的香蕉皮多酚均使肉丸的初始硬度下降，且差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于香蕉皮多酚在一定程度上破壞了肉丸中的蛋白質聚合及交聯結構，引起了硬度的降低[12]。從圖中可看出，添加香蕉皮多酚雖能有效改善肉丸的初始硬度，但不能延緩肉丸硬度的增加。特別是添加低濃度香蕉皮多酚的肉丸其硬度值顯著高于對照組，而中高濃度與對照組相比差異不大，這可能是由于中高濃度時有多余的酚類物質可以形成超氧自由基和過氧化合物從而促進脂肪氧化，使肉丸硬度的增加幅度相比低濃度減小[13]。

由圖3（b）可見，肉丸的彈性呈現出相對穩(wěn)定的結果。在整個貯藏期間，不同香蕉皮多酚添加量與對照組相比大體一致，沒有顯著性差異（P＜0.05）。對比不同香蕉皮多酚濃度對肉丸彈性的影響，發(fā)現添加低濃度香蕉皮多酚的肉丸彈性一直高于其他處理組及對照組。

2.7 香蕉皮多酚對肉丸色差的影響

不同濃度香蕉皮多酚對肉丸色差的影響見表3。

表3 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸色差的影響Table 3 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the color difference of meatballs

顏色是肉制品重要品質之一，是影響消費者購買的主要因素。L*表示肉丸表面的亮度值，a*表示綠紅值（a*為負值時指示綠色，為正值時指示紅色），b*表示藍黃值（b*為負值時指示藍色，為正值時指示黃色），其中a*主要取決于肉中肌紅蛋白的數量和氧化程度[13]。表3為添加不同濃度香蕉皮多酚的肉丸貯藏期間的顏色（L*、a*和b*）變化情況，添加了香蕉皮多酚的肉丸與對照組相比，初始L*、a*和b*值均發(fā)生了不同程度的變化。其中，添加香蕉皮多酚的肉丸L*初始值顯著高于對照組，a*和b*初始值顯著低于對照組。這可能是由于提取得到的香蕉皮多酚本身所具有的黃褐色導致L*增大。隨著貯藏時間的增加，a*值呈下降的趨勢，這可能是由于肌紅蛋白被氧化為高鐵肌紅蛋白[14]。由表中可以看出，在貯藏期間香蕉皮多酚添加組的a*值變化幅度均小于對照組，說明香蕉皮多酚可以抑制肌紅蛋白的氧化，防止肉丸a*值的下降。香蕉皮多酚由于具有抗氧化活性，可以與肉丸中氧合肌紅蛋白競爭脂質過氧化基，阻止肌紅蛋白氧化，從而減緩貯藏期間肉丸的a*值下降速度[15]。

2.8 香蕉皮多酚對肉丸pH值的影響

肉丸在蒸煮過程由于溫度升高，肉中不同蛋白質變性從而引起蛋白表面酸堿基團發(fā)生動態(tài)變化，導致豬肉丸pH值升高[16]，因此，本試驗測得的熟制肉丸pH值比鮮肉本身的pH值略高。不同濃度香蕉皮多酚對肉丸pH值的影響見圖4。

圖4 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸pH值的影響Fig.4 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the pH value of meatballs

由圖4可知，添加不同濃度的香蕉皮多酚后肉丸的初始pH值均呈顯著下降（P＜0.05），這可能是因為香蕉皮多酚提取物本身呈弱酸性，在一定程度上降低了肉丸的pH值。在肉丸貯藏期間，隨貯藏時間的延長，不同添加組肉丸的pH值在貯藏前期有略微上升，而在貯藏后期呈不同程度的下降，這是由于在前期肉丸中的物理化學變化造成蛋白質降解，產生胺類物質，使pH值略微上升，而在貯藏后期由于微生物發(fā)酵產酸，使pH值降低。整個貯藏期間，添加了香蕉皮多酚的肉丸與對照組相比，pH值的改變幅度并不顯著。這是由于在肉丸的貯藏期間香蕉皮多酚發(fā)揮了抑菌作用，防止了肉丸的腐敗變質。有研究表明，植物中的多酚組分能有效抑制食源性病原菌的生長繁殖，并且它們的抑菌活性與多酚含量密切相關[17-18]。在本試驗中，低濃度香蕉皮多酚的添加對肉丸pH值改變的抑制作用更加明顯。而多酚組分之所以具有抗菌活性，是因為它們能夠降解細菌細胞壁，擾亂細胞的胞漿膜，從而引起細胞組分的泄露，還能改變細菌細胞的脂肪酸和磷脂組分，影響DNA和RNA的合成以及破壞蛋白的易位等[19]。

2.9 香蕉皮多酚對肉丸水分活度的影響

水分活度表明的是食品內在的性質，與食品的組成結構有關[20]。有研究表明，水分活度與食品的保鮮質量關系密切，食品中的水活性可以影響食品中細菌、霉菌以及其他微生物的生長，與腐敗變質之間有著直接的關系[21-22]，因此降低食品的水活度可以延長食品的貨架期。不同濃度香蕉皮多酚對肉丸水分活度的影響見圖5。

圖5 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸水分活度的影響Fig.5 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the water activity of meatballs

從圖5可知，整體而言多酚添加組與對照組水分活度數值基本維持在1.0附近。雖添加香蕉皮多酚對肉丸水分活度的影響不大，但仍可看出中高濃度香蕉皮多酚的添加使肉丸初始水分活度顯著下降（P＜0.05），說明中高濃度香蕉皮多酚的添加對貯藏品質變化有減緩作用；而隨著貯藏期的延長，水分活度逐漸上升，這是由于在貯藏的過程中，pH值降低導致肉中蛋白質持水能力下降，游離出大量的自由水，從而提高了水分活度[23]。

2.10 香蕉皮多酚對肉丸感官指標的影響

不同添加組的感官評定指標在貯藏期的評分如表4所示。

表4 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸感官指標的影響Table 4 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the sensory indicators of meatballs

續(xù)表4 不同濃度香蕉皮多酚對肉丸感官指標的影響Continue table 4 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the sensory indicators of meatballs

與對照組相比，多酚添加組由于添加香蕉皮多酚，對肉丸的初始色澤造成一定影響，顏色評分略有下降，但隨著貯藏天數的增加，對照組的顏色暗淡變化更顯著，評分下降明顯，而多酚添加組顏色相對更亮，評分下降緩慢，這與本試驗的色差數據吻合度良好。肉丸的初始風味和組織狀態(tài)受香蕉皮多酚的影響并不顯著，兩者變化趨勢類似。整體來看，隨著貯藏天數的增加，感官指標均有不同程度的下降，但添加香蕉皮多酚的肉丸，在貯藏期的感官評分下降程度均有所減緩，即多酚的添加使肉丸劣變延緩，且中高濃度的添加對肉丸感官評分的延緩影響更顯著。

2.11 香蕉皮多酚對肉丸氣味的影響

添加不同濃度香蕉皮多酚的肉丸在貯藏期間電子鼻分析見圖6。

圖6 不同濃度香蕉皮多酚對第0、3、6、9天肉丸的電子鼻分析Fig.6 Electron nose analysis of meatballs on 0，3，6，9 d

如圖所示，第一主成分和第二主成分的貢獻率在不同時間有所差異，兩者累計貢獻率在第0天、第3天、第6天和第9天分別為90.11%、66.05%、82.39%和71.75%。隨著貯藏天數的增加，不同處理組的散點開始出現部分重合，說明它們的氣味比較相近，在貯藏期間產生了相近的氣味物質。從分布區(qū)域看，添加香蕉皮多酚的肉丸在第6天時其第一主成分相近，第二主成分跨度較大，但是第二主成分的貢獻率較低，所以三者氣味相對較接近，但仍能夠通過第二主成分進行區(qū)分。同時發(fā)現貯藏過程中，各樣品組間的氣味發(fā)生了不同程度的變化，各樣品點分布分散，通過第一主成分分析能夠很好的區(qū)分對照組與處理組的樣品間的氣味關系，同時對照組樣品在貯藏期間的第一主成分和第二主成分分布區(qū)域變化較大，而香蕉皮多酚添加的肉丸雖也能夠通過主成分進行較好的區(qū)分，但相比對照組其主成分分布區(qū)域相近，這說明添加香蕉皮多酚能夠延緩肉丸在貯藏期間由于氧化導致的氣味變化。

3 結論

通過響應面優(yōu)化試驗得到香蕉皮多酚提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%、液料比3.68∶1（mL/g）、浸提溫度80℃、浸提時間1.5 h，在此條件下得到的香蕉皮多酚具有顯著的抗氧化活性。香蕉皮多酚對肉丸貯藏品質的影響結果表明，隨著貯藏時間的延長，添加香蕉皮多酚的肉丸硬度增加沒有減緩，但能有效改善肉丸的初始硬度、然而彈性變化不顯著；香蕉皮多酚添加組的a*值變化幅度小于對照組；肉丸pH值的改變幅度小于對照組；香蕉皮多酚的添加對肉丸水分活度的影響不顯著，但中高濃度的添加能顯著降低初始水分活度；多酚添加組的肉丸感官指標評分下降幅度顯著減緩；貯藏期間多酚添加組肉丸氧化產生的刺激性氣味得到抑制。由此可見，香蕉皮多酚可以改善肉丸的貯藏品質，延長肉制品的貯藏期。