， ，雯晴，，

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)的一層屏障，具有活躍的合成細(xì)胞因子和各種活性物質(zhì)，參與機(jī)體多種生理功能調(diào)節(jié)的作用，內(nèi)皮功能障礙已成為近年來(lái)冠心病心肌缺血的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬是細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白和胞漿成分降解再循環(huán)利用的一種進(jìn)化保守方式，作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及正常生理功能有重要作用[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)在缺血情況下有一定水平的自噬發(fā)生，細(xì)胞凋亡增加；應(yīng)用自噬促進(jìn)劑西羅莫司干預(yù)后增強(qiáng)缺血CMECs自噬，減少凋亡；自噬抑制劑3-MA抑制缺血CMECs自噬，進(jìn)一步增加凋亡。自噬水平變化影響缺血CMECs的結(jié)構(gòu)和功能，推測(cè)這種變化會(huì)進(jìn)一步影響缺血心肌的血管生成，中醫(yī)藥能促進(jìn)缺血心肌血管生成，但基于細(xì)胞自噬探討中藥調(diào)節(jié)血管新生的干預(yù)效應(yīng)鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，觀察祛風(fēng)生脈顆粒對(duì)大鼠缺血CMECs自噬及血管新生的影響，以明確其干預(yù)效應(yīng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠，體重(220～280)g，40只，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。所有大鼠均采用籠養(yǎng)，生存在明暗各12 h飼養(yǎng)環(huán)境中。

1.2 主要儀器 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，透射電鏡(日本JEOL公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heraeus公司)，心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，呼吸機(jī)(美國(guó)BIRD公司)，BIO-RAD電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，Axiovert 40C倒置相差顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)，BIO-RAD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀(日本FUJIFILM公司)。

1.3 藥品與試劑 祛風(fēng)生脈顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，PBS平衡液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，0.25%胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，Western-blot所用試劑(北京Solarbio公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物灌胃及血清制備 選取雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組5只。祛風(fēng)生脈顆粒高劑量組(Q-G組)：3 g/(kg·d)灌胃；祛風(fēng)生脈顆粒中劑量組(Q-Z組)：2 g/(kg·d)灌胃；祛風(fēng)生脈顆粒低劑量組(Q-D組)：1 g/(kg·d)灌胃；空白血清組(KX組)：等體積蒸餾水灌胃。每只大鼠每日上午灌胃1 次，每次4 mL，連續(xù)5 d。于第5天末次灌胃3 h 后打開(kāi)腹腔，在大鼠腹主動(dòng)脈插管，無(wú)菌取血，置無(wú)菌不抗凝管中，室溫下靜置(3～4)h，1 500 r/min離心20 min，吸上清液，無(wú)菌分離血清，同組血清混合，過(guò)濾后置于無(wú)菌試管中，分別制備成Q-G血清、Q-Z血清、Q-D血清和KX血清，于-20 ℃保存。

1.4.2 大鼠急性心肌梗死模型建立 選取雄性SD大鼠16只，參照本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[2]，采用結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死模型。記錄心電圖出現(xiàn)Q波、ST段抬高、T波高聳或倒置，證實(shí)結(jié)扎成功。術(shù)后存活24 h即為造模成功。

1.4.3 培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs 選取造模成功的急性心肌梗死模型大鼠16只及正常SD大鼠4只，參照本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2]，采用組織塊法分別培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs。組織塊周圍有大量細(xì)胞生長(zhǎng)，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液1次，直到細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)均選取二代細(xì)胞進(jìn)行。

1.4.4 分組及藥物干預(yù) 將成功培養(yǎng)的大鼠缺血CMECs隨機(jī)分為4組：Q-G組、Q-Z組、Q-D組、MX組，并將正常大鼠CMECs作為正常組(ZC組)，共5組細(xì)胞。Q-G組、Q-Z組和Q-D組分別給予相應(yīng)濃度含藥血清共孵育，MX組與ZC組給予KX血清孵育。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 透射電鏡觀察自噬小體 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底的80%，消化、離心，小心吸取上清液，向細(xì)胞團(tuán)塊中緩緩加入1.5 mL 3%戊二醛固定液進(jìn)行固定，4 ℃保存，后進(jìn)行雙固定、脫水、浸透、包埋、切片，調(diào)試電鏡，觀察自噬小體以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 Western-blot分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表達(dá) 與上述分組一樣，分別取5組生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度[3]，根據(jù)總上樣量和各組樣本蛋白濃度計(jì)算各組樣本所需樣本量。將樣品液和預(yù)染蛋白標(biāo)記分別上樣，電泳分離蛋白，參照半干轉(zhuǎn)膜儀說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，轉(zhuǎn)印蛋白，于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h，以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉過(guò)的膜加入合適濃度一抗，抗原抗體結(jié)合，4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗，室溫孵育1 h，加入顯色劑，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，應(yīng)用LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀曝光顯影，圖片掃描。應(yīng)用Gel-Pro軟件分析數(shù)字化圖像上每個(gè)特異條帶的灰度值。各組樣本目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得數(shù)值為各組樣本目的蛋白的相對(duì)含量。

1.5.3 劃痕法觀察細(xì)胞遷移 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至近80%融合時(shí)，將各組細(xì)胞分別消化接種于24孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后用滅菌的10 μL槍頭在24孔板底部中間位置劃出一個(gè)“十”字形劃痕空白區(qū)域，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0 h、24 h在倒置相差顯微鏡下觀察并于劃痕處拍照，觀察劃痕愈合能力，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)。

1.5.4 倒置顯微鏡觀察管腔結(jié)構(gòu)形成 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至近80%融合時(shí)，將各組細(xì)胞分別消化接種于5個(gè)6孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，接種后48 h于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞管腔結(jié)構(gòu)形成情況，以細(xì)胞連接呈C形即算一個(gè)管腔。每孔取3處管腔密集的視野，在放大(100×)的視野計(jì)數(shù)管腔數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)獲取6個(gè)圖像，取平均值，計(jì)算管腔形成數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體及超微結(jié)構(gòu)變化 電鏡是自噬研究中不可或缺的重要手段，其他非形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法獲得的結(jié)果，往往需要電鏡進(jìn)行驗(yàn)證，某些特定的自噬類型和細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)的辨別也往往需要借助電鏡進(jìn)行觀察[4]。本實(shí)驗(yàn)在電鏡下觀察到ZC組細(xì)胞胞質(zhì)均勻，細(xì)胞內(nèi)空泡少，核染色質(zhì)均勻分布，未見(jiàn)到自噬小體。與ZC組相比，MX組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)到大小不等的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，線粒體形態(tài)腫脹變形，且有較多空泡，未觀察到自噬溶酶體，提示自噬小體發(fā)生堆積，與溶酶體結(jié)合障礙，自噬流被抑制。各濃度梯度含藥血清組自噬小體聚集趨于增多，同時(shí)還觀察到數(shù)目較多的自噬溶酶體，自噬溶酶體中包含部分胞質(zhì)成分以及尚未消化的細(xì)胞器。Q-G組自噬溶酶體數(shù)目最多，提示自噬活力增強(qiáng)，自噬流暢通。詳見(jiàn)圖1。

A為ZC組，B為MX組，C為Q-D組，D為Q-Z組，E為Q-G組。圖中白色箭頭所示為核仁，黑色實(shí)心箭頭所示為自噬小體，黑色空心箭頭所示為自噬溶酶體

2.2 各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果表明：與ZC組相比，MX組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62表達(dá)均升高(P<0.05)；與MX組相比，Q-D組和Q-Z組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，P62表達(dá)降低(P<0.05)；與MX組相比，Q-G組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P<0.01)，P62表達(dá)明顯降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62表達(dá)情況

2.3 各組細(xì)胞劃痕愈合情況比較 倒置顯微鏡下(50×)觀察各組細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，劃痕后0 h(見(jiàn)圖3 A-E)5組細(xì)胞均可見(jiàn)明顯劃痕空白區(qū)；24 h后(見(jiàn)圖3 F-J)，ZC組(見(jiàn)圖3 F)可見(jiàn)劃痕兩側(cè)大量細(xì)胞遷移至空白區(qū)域，MX組(見(jiàn)圖3 G)僅有少量細(xì)胞遷移至空白區(qū)域，與ZC組比較，細(xì)胞遷移數(shù)明顯較少(P<0.05)； Q-D組和Q-Z組(見(jiàn)圖3 H、I)劃痕空白區(qū)可見(jiàn)大量遷移的細(xì)胞，與MX組比較，細(xì)胞遷移數(shù)增多(P<0.05)；Q-G組(見(jiàn)圖3 J)，劃痕區(qū)域可見(jiàn)遷移的細(xì)胞鋪滿接近空白區(qū)域的50%，遷移細(xì)胞數(shù)較MX組明顯增多(P<0.01)。

2.4 各組細(xì)胞管腔結(jié)構(gòu)形成情況比較 倒置顯微鏡下(100×)觀察各組細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況。結(jié)果顯示，接種后48 h，ZC組(見(jiàn)圖4 A)可見(jiàn)較多數(shù)目的C形及管腔樣結(jié)構(gòu)形成；與ZC組比較，MX組(見(jiàn)圖4 B)僅可見(jiàn)少量C形結(jié)構(gòu)，成管數(shù)減少(P<0.05)；與MX組比較，Q-D組和Q-Z組(見(jiàn)圖4 C、D)管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)目逐漸增多(P<0.05)，與MX組比較，Q-G組(見(jiàn)圖4 E)可見(jiàn)C形結(jié)構(gòu)明顯增多(P<0.01)，并且能夠見(jiàn)到較多的相對(duì)較完整的管腔結(jié)構(gòu)。

3 討 論

自噬是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，廣泛參與各種生理和病理過(guò)程。既往對(duì)自噬的研究多以自噬體的多少評(píng)價(jià)自噬水平的強(qiáng)弱，新近發(fā)現(xiàn)自噬體的增加并不能從本質(zhì)上反映自噬的水平，僅僅能夠反映自噬的誘導(dǎo)，或者自噬體清除的抑制。因此，如何準(zhǔn)確客觀地評(píng)價(jià)自噬水平顯得尤為重要。自噬是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、多步驟的生物過(guò)程，大致可以分為4個(gè)部分：自噬膜、自噬體、自噬內(nèi)涵體及自噬溶酶體，其中自噬體與內(nèi)涵體結(jié)合形成自噬內(nèi)涵體，自噬內(nèi)涵體或自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體[5-7]?，F(xiàn)有的大部分文獻(xiàn)都是通過(guò)檢測(cè)自噬體的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)自噬水平，基于上述流程發(fā)現(xiàn)通過(guò)電鏡等手段檢測(cè)到的自噬體的積累，既可以反映自噬的誘導(dǎo)，也可以反映自噬體的消耗減少[8-11]，例如，溶酶體低效率的融合，影響到整個(gè)底物運(yùn)輸過(guò)程，會(huì)抑制自噬體向自噬溶酶體的成熟轉(zhuǎn)化，當(dāng)然自噬底物降解速率的減慢也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)自噬流程的減弱[12-13]，從而出現(xiàn)自噬體的蓄積。如何正確評(píng)價(jià)自噬水平就需要區(qū)分通常情況下自噬體短暫的蓄積是因?yàn)檎T導(dǎo)導(dǎo)致的，還是自噬完成的效率低下導(dǎo)致的。既要靜態(tài)檢測(cè)自噬體，也需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)自噬底物來(lái)證實(shí)底物到達(dá)了溶酶體，并且在合適的時(shí)間被降解。近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為通過(guò)電鏡等形態(tài)學(xué)手段辨別自噬體與自噬溶酶體形成情況，結(jié)合Western blot檢測(cè)P62蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，能夠較全面地反映整個(gè)自噬流的過(guò)程，客觀體現(xiàn)自噬水平的強(qiáng)弱。一般情況下，P62蛋白水平的高低與自噬的活性成反比，P62 的增加提示自噬/溶酶體降解途徑被抑制[14]。本研究結(jié)果顯示，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)MX組細(xì)胞存在自噬小體，表明缺血CMECs有一定水平的自噬，但未觀察到自噬溶酶體，為了進(jìn)一步明確缺血CMECs自噬水平，運(yùn)用Western blot 檢測(cè)了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MX組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62表達(dá)均升高，表明MX組自噬小體發(fā)生堆積，與溶酶體結(jié)合障礙，自噬流被抑制。加入不同濃度梯度的祛風(fēng)生脈顆粒含藥血清干預(yù)后，電鏡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)除自噬小體外，還存在較多自噬溶酶體，結(jié)合Western blot檢測(cè)結(jié)果LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，P62表達(dá)降低，表明各含藥血清組干預(yù)后增強(qiáng)了缺血CMECs自噬水平，整個(gè)自噬流暢通。

A為ZC組，B為MX組，C為Q-D組，D為Q-Z組，E為Q-G組，F(xiàn)為ZC組，G為MX組，H為Q-D組，I為Q-Z組，J為Q-G組

A為ZC組，B為MX組，C為Q-D組，D為Q-Z組，E為Q-G組

圖4各組細(xì)胞管腔形成情況比較(100×)

本研究觀察了缺血CMECs加入不同濃度梯度的祛風(fēng)生脈顆粒含藥血清干預(yù)后，各組細(xì)胞遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成的差異。發(fā)現(xiàn)缺血CMECs無(wú)論是遷移還是管腔形成均較正常CMECs減少，表明缺血CMECs血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)均受到抑制。祛風(fēng)生脈顆粒干預(yù)后，細(xì)胞遷移數(shù)及管腔形成數(shù)均明顯增加，而且在高劑量組可以見(jiàn)到更加完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，血管生成更加成熟，提示祛風(fēng)生脈顆粒促進(jìn)血管新生的作用與藥物劑量成正相關(guān)，分析其機(jī)制可能與增強(qiáng)缺血CMECs自噬流有關(guān)。

綜上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管生成的靶細(xì)胞，缺血導(dǎo)致CMECs損傷在一定程度上影響了血管的新生以適應(yīng)缺血的變化，過(guò)去的研究多集中于促血管生成方面。新近研究發(fā)現(xiàn)，自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)，本研究以細(xì)胞自噬在血管內(nèi)皮缺血損傷中的作用為切入點(diǎn)，以缺血CMECs為研究對(duì)象，明確了自噬在缺血CMECs血管新生中的作用，基于細(xì)胞自噬探討了祛風(fēng)生脈顆粒調(diào)節(jié)缺血心肌血管新生的干預(yù)效用，為中醫(yī)藥與細(xì)胞自噬研究提供了新的思路與方法。