張桂菊，王肖彥，王 瑞，陳芳莉，徐寶財

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048)

單脂肪酸甘油酯具有良好的乳化、分散、抑菌等作用，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-4]。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，酶法合成單脂肪酸甘油酯具有反應(yīng)條件溫和、耗能低、產(chǎn)品安全性高、無污染等優(yōu)點[5]。但是，在低溫條件下親脂性的反應(yīng)底物(如油脂、三脂肪酸甘油酯等)與親水性的反應(yīng)底物甘油的混溶性差，導(dǎo)致酶法合成單脂肪酸甘油酯的反應(yīng)效率較低[6]。查寶萍等[7]在無溶劑體系中采用固定化脂肪酶催化椰子油制備單月桂酸甘油酯，在最佳反應(yīng)條件下所得混合脂肪酸甘油酯中單月桂酸甘油酯含量僅為30%左右。因此，采用適宜的反應(yīng)體系對于酶催化制備單脂肪酸甘油酯具有至關(guān)重要的作用。通過加入有機(jī)溶劑，可以增加底物溶解度、提高反應(yīng)物的混溶性，從而加快反應(yīng)速率并提高反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率。但是，有機(jī)溶劑可能會使脂肪酶變性失活，影響其催化活性和穩(wěn)定性[8]。超臨界CO2、離子液體等也可作為酶催化制備單脂肪酸甘油酯的反應(yīng)媒介，但是成本較高[9]。相對而言，反膠束體系易于制備、價格較為低廉，對親水和親油底物均具有良好的增溶性，有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行，具有良好的應(yīng)用前景。Itabaiana等[10]采用硬脂酸與丙酮縮甘油在AOT/異辛烷反膠束體系中進(jìn)行脂肪酶催化酯化反應(yīng)制備單硬脂酸甘油酯，反應(yīng)僅30 min產(chǎn)率即可達(dá)80%。Park等[11]研究發(fā)現(xiàn)，羧酸酯酶在AOT/異辛烷反膠束體系中，催化活性最高，最優(yōu)條件下催化癸酸與甘油進(jìn)行酯化反應(yīng)制備1-單癸酸甘油酯產(chǎn)率可達(dá)80%以上。

本文研究了AOT/異辛烷反膠束體系的黏度及增溶水量等特性，同時考察了反應(yīng)時間、AOT質(zhì)量濃度、含水量、脂肪酶濃度、緩沖液pH、底物摩爾比等因素對脂肪酶催化合成單月桂酸甘油酯的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三月桂酸甘油酯(純度>96%)，單月桂酸甘油酯、雙月桂酸甘油酯(純度>99%，Sigma-Aldrich公司)；AOT(純度≥97%)，異辛烷(分析純)，甘油(99.5%)，乙腈、丙酮(色譜純)，卡爾費休試劑(分析純)，奶酪香精脂肪酶(酶活力20 000 IU/g，丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司)。

IS-RSV1立式恒溫振蕩器，Agilent1200高效液相色譜(安捷倫科技有限公司)，BSA423S電子天平，烏式毛細(xì)管黏度計，WS-6型微量水分測定儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 AOT/異辛烷反膠束溶液的配制

將適量AOT溶于異辛烷中，配成一定濃度的AOT/異辛烷溶液。稱取適量奶酪香精脂肪酶于磷酸鹽緩沖液中，用微量注射器將含酶緩沖液注入到AOT/異辛烷溶液中，振蕩混合至溶液澄清，即得含酶的AOT/異辛烷反膠束溶液。

1.2.2 反膠束溶液黏度的測定

移取10 mL純?nèi)軇┊愋镣橹翞跏橡ざ扔嬛?，恒?0 min，測定純?nèi)軇┑牧鬟^時間。另移取10 mL反膠束溶液于烏氏黏度計中，測定反膠束溶液的流過時間。

根據(jù)Poiseuille方程，反膠束溶液和純?nèi)軇┑酿ざ圈呛挺?可以按方程式(1)和(2)進(jìn)行計算：

η=kρt

(1)

η0=kρt0

(2)

式中：t、t0分別為反膠束溶液和純?nèi)軇┑牧鬟^時間，s；k為黏度計常數(shù)，0.014 17 mm2/s2；ρ為純?nèi)軇┑拿芏龋?.69 g/cm3。

相對黏度：ηr=η/η0

(3)

增比黏度：ηsp=(η-η0)/η0=ηr-1

(4)

1.2.3 Karl-Fischer法測定反膠束體系的增溶水量(W0)

在滴定瓶中加入一定量無水甲醇，用Karl-Fischer 試劑將甲醇中水分滴去，然后用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確向甲醇溶液加入10 μL蒸餾水，再用Karl-Fischer 試劑將溶液滴定至終點。從水分滴定儀上讀取所消耗溶液量，得出Karl-Fischer試劑相應(yīng)系數(shù)。

用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確取反膠束溶液50 μL，迅速加入無水甲醇溶液中，用Karl-Fischer試劑將其滴定至終點，從水分滴定儀上準(zhǔn)確讀取所消耗Karl-Fischer試劑體積，計算反膠束體系中增溶水的物質(zhì)的量。

反膠束溶液中W0計算：

W0=反膠束增溶水的物質(zhì)的量/反膠束體系中表面活性劑的物質(zhì)的量

(5)

1.2.4 反膠束“水池”直徑的計算

根據(jù)Kinugasa等[12]的研究，“水池”直徑dwp滿足以下公式：

dwp=0.25W0+1.14

(8)

1.2.5 反膠束體系中酶催化合成單月桂酸甘油酯

向反膠束體系中加入1 g三月桂酸甘油酯和一定量的甘油(甘油已采用4 ?型分子篩除水)置于立式恒溫振蕩器，在一定的條件下進(jìn)行反應(yīng)，定時取樣進(jìn)行液相色譜分析。

1.2.6 定量分析單月桂酸甘油酯含量

采用高效液相色譜-示差折光檢測器(HPLC-RID)進(jìn)行定量分析。分析條件：進(jìn)樣量20 μL，流動相為乙腈-丙酮(1∶1)，流動相流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測器溫度40℃。

定量分析方法采用外標(biāo)法。分別配制不同質(zhì)量濃度的三月桂酸甘油酯、雙月桂酸甘油酯和單月桂酸甘油酯溶液，溶劑為乙腈-丙酮(體積比1∶1)，進(jìn)行液相色譜分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，液相色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性擬合得到：單月桂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-13 378.090 32+145 361.690 32x(R2=0.998 57)；雙月桂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10 643.812 1+142 003.302 9x(R2=0.997 88)；三月桂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=47 708.012 9+139 361.428 2x(R2=0.998 57)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同含水量AOT反膠束體系的W0與黏度

在反膠束體系A(chǔ)OT質(zhì)量濃度0.06 g/mL、緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，改變反膠束體系的含水量，研究不同含水量對反膠束體系的W0、“水池”直徑及黏度等特性的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同含水量的AOT反膠束體系的W0與黏度

由表1可以看出，隨著含水量的增大，反膠束體系的W0隨之增大，“水池”直徑隨著W0的增大而逐漸增大，“水池”溶解極性物質(zhì)的能力也隨之增大，反膠束基團(tuán)聚集數(shù)增多。反膠束的W0是決定反膠束結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì)的重要物理參數(shù)，反膠束的“水池”直徑與其含水量成正比。因此，W0本身也反映了反膠束的大小[13]。當(dāng)含水量達(dá)到0.09 mL/mL后，體系變渾濁，W0變化緩慢，說明加水達(dá)到一定程度后，“水池”中的水已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，若加水量過大，將會增強(qiáng)水與界面的相互作用，破壞反膠束溶液結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致反膠束出現(xiàn)分相現(xiàn)象，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。因此，含水量范圍確定為0.02～0.09 mL/mL。

AOT反膠束溶液黏度隨含水量增大先增加后降低。當(dāng)含水量增大時，表面活性劑極性基頭與水分子的水化作用加強(qiáng)，會形成更多的聚集數(shù)，膠束之間的相互作用增強(qiáng)，黏度隨之增高[14]。反膠束不是剛性球體，當(dāng)含水量達(dá)到0.09 mL/mL后，“水池”的形狀可能從球形或近球形到柱形之間變化，不同的形狀會導(dǎo)致膠束聚集數(shù)的變化，從而引起黏度改變[15]。

2.2 不同質(zhì)量濃度AOT反膠束體系的W0與黏度

在反膠束體系含水量0.05 mL/mL、緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，改變AOT的添加量，研究不同AOT質(zhì)量濃度對反膠束體系的W0、“水池”直徑及黏度等特性的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同AOT質(zhì)量濃度的反膠束體系的W0與黏度

由表2可以看出，隨著AOT質(zhì)量濃度的增加，W0、“水池”直徑及黏度也增加。這是因為表面活性劑的極性基頭與水分子強(qiáng)烈的水化作用，會形成較多的聚集束，膠束之間的相互作用增強(qiáng)，而黏度也會隨之增加。因此，表面活性劑的質(zhì)量濃度會影響反膠束體系的黏度以及“水池”的直徑。

2.3 反膠束體系單月桂酸甘油酯合成單因素實驗

2.3.1 反應(yīng)時間的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量60 mg/mL時，考察反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

從圖1可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在反應(yīng)時間達(dá)到10 h后，三月桂酸甘油酯、單月桂酸甘油酯和雙月桂酸甘油酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本不變，反應(yīng)達(dá)到平衡。綜合考慮，確定較優(yōu)的反應(yīng)時間為10 h。

2.3.2 緩沖液pH對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應(yīng)時間10 h、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、脂肪酶用量60 mg/mL、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL時，考察緩沖液pH對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 緩沖液pH對反應(yīng)的影響

酶分子上有很多酸性、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，其隨著pH的變化處于不同的解離狀態(tài)，直接影響與底物的結(jié)合和進(jìn)一步的反應(yīng)，從而影響酶的活性[16]。即體系pH的改變將引起酶構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響酶的催化能力。在陰離子表面活性劑AOT反膠束體系中，酶則依靠疏水作用到達(dá)油水界面，而且pH過高時帶負(fù)電荷的酶甚至?xí)c陰離子表面活性劑產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電排斥，導(dǎo)致酶在油水界面上的濃度迅速降低，從而對反應(yīng)結(jié)果造成影響[17]。由圖2可知，隨著緩沖液pH的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，緩沖液pH為7.5時達(dá)到83.4%，緩沖液pH超過7.5后，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。因此，采用pH為7.5的磷酸鹽緩沖液。

2.3.3 脂肪酶用量對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應(yīng)時間10 h、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL時，考察脂肪酶用量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 脂肪酶用量對反應(yīng)的影響

從圖3可以看出，隨著脂肪酶用量的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，在50 mg/mL時達(dá)到最大，為83.4%，當(dāng)脂肪酶用量超過50 mg/mL之后，對單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較小。這可能是由于在催化劑用量較少時，底物相對于酶較為充足，酶被充分利用，故單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著脂肪酶用量的增加而增加；當(dāng)脂肪酶用量增加到一定程度時，酶相對于底物而言已經(jīng)過剩，對反應(yīng)的影響較小[18]。因此，選擇脂肪酶用量為50 mg/mL。

2.3.4 底物摩爾比對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應(yīng)時間10 h、含水量0.05 mg/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察底物摩爾比對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物摩爾比對反應(yīng)的影響

由圖4可知，當(dāng)甘油與三月桂酸甘油酯的摩爾比為1∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.6%，增加體系中甘油的量，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)?shù)孜锬柋葹?∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.5%。底物摩爾比增加至4∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到83.3%，再繼續(xù)增大甘油的量，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低。原因可能是在一定范圍內(nèi)，增加反應(yīng)物甘油的量有利于反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，超過一定量時，過量的甘油包覆在脂肪酶表面導(dǎo)致其失活[19]。從經(jīng)濟(jì)性的角度考慮，較優(yōu)底物摩爾比為3∶1。

2.3.5 含水量對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應(yīng)時間10 h、底物摩爾比3∶1、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察含水量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 含水量對反應(yīng)的影響

由圖5可知，反應(yīng)體系含水量低，反膠束“水池”中的絕大部分水與表面活性劑結(jié)合，用于反膠束的構(gòu)成而保持反膠束中酶活性構(gòu)象所需的自由水減少，影響酶活力的提高[20]，且形成的反膠束的尺寸不能完全包含酶分子，導(dǎo)致酶的活力不高，隨著含水量的增大，維持酶構(gòu)象的自由水增多，酶的活性增大，在含水量為0.05 mL/mL時達(dá)到最佳，當(dāng)含水量大于0.05 mL/mL時，隨著含水量的增大，不僅使油水界面減小，而且可能導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)過于松弛，柔性過大，影響酶活力的發(fā)揮。另外，含水量過大將使反應(yīng)向反方向移動，不利于單脂肪酸甘油酯的生成。因此，最佳含水量為0.05 mL/mL。

2.3.6 AOT質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應(yīng)時間10 h、底物摩爾比3∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察AOT質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 AOT質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響

表面活性劑(AOT)質(zhì)量濃度關(guān)系到反膠束的形成和酶的催化活性，AOT質(zhì)量濃度太低，無法形成反膠束溶液，而AOT質(zhì)量濃度太高，對脂肪酶有毒害作用，抑制酶的活性[21]。由圖6可知，隨著AOT質(zhì)量濃度的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，當(dāng)AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，單月桂酸甘油酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為84.2%。繼續(xù)增加AOT質(zhì)量濃度，由于對脂肪酶催化活性的抑制作用，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始下降。因此，最佳AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

在上述優(yōu)化的工藝條件(反應(yīng)時間10 h，緩沖液pH 7.5，脂肪酶用量50 mg/mL，底物摩爾比3∶1，含水量0.05 mL/mL，AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL)以及反應(yīng)溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min下，重復(fù)3次驗證實驗，反應(yīng)體系單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.4%。

2.4 反膠束體系特性與酶催化反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)性

反膠束酶催化反應(yīng)體系是一個熱力學(xué)動態(tài)平衡的體系，酶分子在反膠束中所處的位置取決于酶自身的親水/疏水特性。脂肪酶具有油/水界面親和力，一般位于油水界面的內(nèi)表面或者疏水尾鏈區(qū)域[22]，如圖7所示。

圖7 反膠束脂肪酶催化反應(yīng)示意圖

對于脂肪酶催化三月桂酸甘油酯與甘油進(jìn)行甘油解反應(yīng)而言，親水性的底物甘油可溶于反膠束體系的納米水核，而親脂性的底物三月桂酸甘油酯溶于有機(jī)溶劑或附著于油水界面的表面活性劑膜上，底物與酶分子在油/水界面接觸并發(fā)生催化反應(yīng)。由于反膠束均為納米尺度，具有非常大的界面積，從而加快酶催化反應(yīng)的速度。

增溶水量(W0)是表征反膠束微聚集體大小的基本特性參數(shù)之一，而體系黏度對于酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)作用具有非常重要的影響，因此結(jié)合2.1、2.2以及2.3.5、2.3.6部分的實驗數(shù)據(jù)，分析了反膠束體系增溶水量和相對黏度與酶催化反應(yīng)體系中單月桂酸甘油酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。

當(dāng)含水量為0.02～0.07 mL/mL時，W0隨著含水量的增加而線性增加，之后W0增速減緩，當(dāng)含水量增加至0.08 mL/mL后W0變化不大。當(dāng)含水量為0.02～0.05 mL/mL時，體系相對黏度隨著含水量的增加而顯著增加，當(dāng)含水量增加至0.05 mL/mL后體系相對黏度變化較小。當(dāng)AOT質(zhì)量濃度為0.02～0.10 g/mL時，W0隨著AOT質(zhì)量濃度增加而線性增加，之后增速減緩。反膠束體系的黏度隨著AOT質(zhì)量濃度(0.02～0.16 g/mL)增加而線性增加。由圖5、圖6可知，酶催化反應(yīng)體系中單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著含水量、AOT質(zhì)量濃度的增加先增大后減小，當(dāng)含水量為0.05 mL/mL、AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大。

綜合上述結(jié)果可知，當(dāng)AOT質(zhì)量濃度和含水量較小時，隨著AOT質(zhì)量濃度、含水量的增加，W0增加，反膠束體系增溶底物的量增加，且體系黏度較小，因此促進(jìn)了酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。但是當(dāng)AOT質(zhì)量濃度和含水量增加到一定程度之后，W0繼續(xù)增加，雖然增溶底物的量增加，但是反膠束的尺寸也隨之增加，從而油/水界面積減小，同時體系黏度的增加影響了底物與脂肪酶之間的傳質(zhì)作用，因此不利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。另外，如前所述，反膠束體系中的水及AOT對酶的結(jié)構(gòu)和活性都有一定的影響，反膠束體系對于酶催化反應(yīng)的影響機(jī)制非常復(fù)雜，還有待深入研究。

3 結(jié) 論

AOT/異辛烷反膠束體系中，采用三月桂酸甘油酯與甘油進(jìn)行脂肪酶催化甘油解反應(yīng)制備單月桂酸甘油酯，通過單因素實驗對合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度55℃，振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min，AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL，含水量0.05 mL/mL，脂肪酶用量50 mg/mL，緩沖液pH 7.5，底物摩爾比(甘油與三月桂酸甘油酯摩爾比)3∶1，反應(yīng)時間10 h。在最佳條件下，反應(yīng)體系中單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.4%。通過對AOT反膠束體系的一些基本特性的研究，對脂肪酶催化甘油解制備單脂肪酸甘油酯反應(yīng)條件的選擇提供參考。同時對于反膠束體系增溶水量及體系黏度與酶催化反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行了分析，但是對于反膠束體系的基本特性對酶催化反應(yīng)的影響機(jī)制還有待深入研究。