孟繁磊，宋志峰，王巍巍，楊 建，魏春雁

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 長春 130033)

伏馬毒素(Fumonisin，F(xiàn)B)是由串珠鐮刀菌(FusariummoniliformeSheld)產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[1]。1988年，Gelderblon等[2]首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。隨后，Laurent等又從伏馬毒素中分離出伏馬毒素B1(FB1)和伏馬毒素B2(FB2)。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素中FB1是其主要組分。有報(bào)道指出，伏馬菌素對(duì)人、畜不僅是一種促癌物，而且完全是一種致癌物，可以損害肝腎功能，引起馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫[3-4]。FB1對(duì)食品污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，主要污染玉米及玉米制品[5]。由于玉米是我國最重要的糧食作物之一， 主要用于人類和動(dòng)物的直接食用。因此，建立可靠、簡(jiǎn)便、靈敏、高效的玉米中伏馬毒素的檢測(cè)方法，可為我國食品安全提供必要的技術(shù)支撐，對(duì)保護(hù)人們的身體健康也具有重要意義。

目前，已經(jīng)報(bào)道了多種測(cè)定伏馬毒素的方法，主要有薄層色譜法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-15]等。近年來，伏馬毒素的檢測(cè)方法主要是采用免疫親和柱(IAC)、固相萃取柱(SPE)、多功能凈化柱等凈化方法，結(jié)合液相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。但這些方法都有一些缺點(diǎn)，如非同步提取、多個(gè)步驟和可能的交叉反應(yīng)等，且所需的材料成本都很高。QuEChERS方法最早應(yīng)用于水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、堅(jiān)固和安全的特點(diǎn)，適用于批量樣品的快速檢測(cè)。本研究改進(jìn)QuEChERS樣品制備方法，使樣品的前處理過程簡(jiǎn)單快速，并適用于玉米中伏馬毒素的提取凈化，同時(shí)結(jié)合UPLC-QTRAP-MS/MS技術(shù)，采用多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)-信息依賴采集(IDA)-增強(qiáng)子離子掃描(EPI)模式檢測(cè)，可更加準(zhǔn)確地進(jìn)行陽性判別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

2017年秋季從吉林省各市縣收集玉米樣品50份。將研磨和徹底均質(zhì)的樣品轉(zhuǎn)移到氣密塑料袋中，密封，并在室溫下儲(chǔ)存在干燥器中，待測(cè)。

乙腈、甲醇、甲酸：色譜級(jí)；無水硫酸鎂、氯化鈉：分析純；PSA、C18：美國安捷倫公司；中性氧化鋁；伏馬毒素B1(50 μg/mL)、伏馬毒素B2(50 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品：奧地利Biopμre公司；石墨化碳黑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AB QTRAP 5500質(zhì)譜儀：美國AB Sciex；Shimadzu LC-30A超高效液相色譜儀：日本島津公司；RM 2255渦旋混勻器：德國IKA公司；SC-3610離心機(jī)；NR-3空氣浴振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品改良QuEChERS法前處理

1.2.1.1 提取

準(zhǔn)確稱取2.5 g(精確至0.001 g)玉米粉于50 mL刻度離心管中，對(duì)于加標(biāo)樣品，加入所需體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液；加入10 mL提取液(乙腈-水-甲酸，體積比50∶40∶10)，旋渦混勻30 s，振蕩1.5 h，然后加入無水硫酸鎂和氯化鈉各3.0 g，劇烈振搖1 min；5 000 r/min離心5 min，取上層清液待凈化。

1.2.1.2 凈化

取2.0 mL待凈化液轉(zhuǎn)移到含有無水MgSO4(0.3 g)+ C18(0.05 g)+ 中性氧化鋁(0.05 g)+ PSA(0.1 g)+石墨化碳黑(0.10 g)的離心管內(nèi)，旋渦混勻30 s，以5 000 r/min離心5 min，取上層0.5 mL過0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中，加入0.5 mL水，混合均勻后UPLC-QTRAP-MS/MS待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取100 μL的伏馬毒素B1、B2標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配成質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的儲(chǔ)備液，于-20℃保存。取空白玉米樣品，按照1.2.1制備樣品，得空白樣品提取液，用空白提取液配制伏馬毒素B1、B2質(zhì)量濃度均為10、20、50、100、500 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 UPLC-MS/MS條件

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，20%～95%B；10～15 min，95%～95%B；15.1～20 min，20%B；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子掃描；離子化電壓5.5 kV；氣簾氣241 kPa；霧化溫度550℃；霧化氣379 kPa；輔助氣414 kPa。其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

監(jiān)測(cè)方式：MRM-IDA-EPI；IDA參數(shù)：1 000 CPS觸發(fā)啟動(dòng)，采用動(dòng)態(tài)背景扣除模式；EPI參數(shù)：掃描速度10 000 Da/s，掃描范圍(m/z)50～900 Da；EPI碰撞能量：20、35 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 MS/MS條件的優(yōu)化

將伏馬毒素B1、B2配成100 μg/L的單標(biāo)，通過針泵直接進(jìn)樣，優(yōu)化確定[M+H]+作為母離子，然后優(yōu)化DP電壓，最后采用子離子掃描選擇2個(gè)響應(yīng)值最強(qiáng)的子離子，建立MRM離子對(duì)通道，優(yōu)化碰撞電壓(CE)。伏馬毒素B1、B2監(jiān)測(cè)離子對(duì)、DP電壓、碰撞電壓見表1。

表1 伏馬毒素B1、B2監(jiān)測(cè)離子對(duì)、DP電壓和碰撞電壓

2.1.2 色譜條件的選擇

伏馬毒素B1、B2均在正離子模式下有較高響應(yīng)，所在水相中加入一定比例的酸可以促進(jìn)電離，所以選用較為常用的0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。通過比較色譜分析方法中常用的甲醇和乙腈分別作為有機(jī)相時(shí)對(duì)色譜分離的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇作為有機(jī)相時(shí)，化合物的響應(yīng)值較高。因此綜合考慮，選擇使用0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相體系。在此條件下伏馬毒素B1、B2可得到較好地分離(見圖1)。

圖1伏馬毒素B1、B2的色譜圖

2.2 定性方法的確認(rèn)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在測(cè)定過程中，一般常常認(rèn)為離子對(duì)“出峰”即為檢出，即為陽性結(jié)果，但在實(shí)際檢測(cè)過程中由于基質(zhì)的復(fù)雜和干擾較大，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，進(jìn)而影響篩查結(jié)果的正確性和篩查報(bào)告的嚴(yán)謹(jǐn)性。本研究利用超高液相色譜-三重四級(jí)桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(UPLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，采用MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式，使伏馬毒素在出峰時(shí)，一旦響應(yīng)超過預(yù)設(shè)的數(shù)值，便自動(dòng)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描模式(EPI)，能夠得到更低濃度化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖，該譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖比對(duì)，可進(jìn)行更準(zhǔn)確的陽性判別。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限

取1.2.2空白玉米樣品基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按照1.2.3的條件進(jìn)行測(cè)定，以伏馬毒素B1、B2的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比的3倍和10倍計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 FB1、FB2線性方程、檢出限、定量限

2.3.2 方法的回收率與精密度

取空白玉米基質(zhì)，選擇低(LOQ)、中(2×LOQ)、高(5×LOQ)3個(gè)不同添加水平，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均值、回收率，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。由表3可知，伏馬毒素平均回收率在89.11%～104.61%之間，RSD為2.33%～9.89%，方法顯示了較好的回收率與精密度，符合GB/T 27404—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范。

表3 回收率與精密度結(jié)果

2.4 方法比較

取玉米空白樣品12份，制成20 μg/kg加標(biāo)陽性樣品，分別按照本方法和GB 5009.240—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測(cè)定》中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(免疫親和柱凈化)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 方法比較結(jié)果(n=6)

由表4可知，利用2種方法檢測(cè)玉米粉中的2種伏馬毒素，在對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)(α為0.05)時(shí)，2種方法無顯著性差異，證明本方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)際可行。但是本方法檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低。

2.5 方法應(yīng)用

利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法，對(duì)吉林省內(nèi)采集的50份玉米樣品中伏馬毒素B1、B2進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，玉米樣品受伏馬毒素的污染較為嚴(yán)重，42個(gè)樣品檢出伏馬毒素B1，污染水平范圍151.12～805.6 μg/kg，低于歐盟規(guī)定的直接供人類消費(fèi)的玉米及其制品的限量標(biāo)準(zhǔn)(1 000 μg/kg)。

3 結(jié) 論

采用改良QuEChERS樣品制備方法，將樣品與酸化的乙腈水溶液混合振蕩提取，然后使用MgSO4、NaCl進(jìn)行鹽析液體分配，通過用MgSO4、PSA、C18、石墨化碳黑和中性氧化鋁分散固相萃取凈化，C18色譜柱分離，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，正模式掃描，采用多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)-信息依賴采集(IDA)-增強(qiáng)子離子掃描(EPI)模式檢測(cè)，在線EPI譜庫定性分析，外標(biāo)法定量。與國標(biāo)方法相比，檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，但本方法操作簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)時(shí)間縮短，檢測(cè)成本降低，可為玉米中伏馬毒素含量的測(cè)定提供檢測(cè)依據(jù)，也可為其他基質(zhì)中伏馬毒素的評(píng)估提供技術(shù)支撐。