劉加 梁官釗 劉維達(dá)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所 中國醫(yī)學(xué)真菌菌種保藏管理中心,南京 210042)

皮膚癬菌是臨床最常見的病原真菌，包括表皮癬菌屬、小孢子菌屬及毛癬菌屬，因其具有嗜角蛋白的特性，可引起人類頭發(fā)、光滑皮膚及指趾甲的感染，全球發(fā)病率約為20%～25%[1]。盡管皮膚癬菌病不少見，但一方面因?yàn)槠つw癬菌多感染皮膚角質(zhì)層及甲，部分人僅因?yàn)槊烙^而非醫(yī)療問題就診；另一方面則因?yàn)槠つw癬菌對常用抗真菌藥敏感，耐藥少見，因此目前有關(guān)皮膚癬菌的研究甚少[2]。表皮癬菌屬中則只有絮狀表皮癬菌引起人類致病，多感染皮膚及指趾甲，頭發(fā)感染甚為少見，說明絮狀表皮癬菌與紅色毛癬菌、犬小孢子菌等具有不同的特征，但是目前相關(guān)研究少見。因經(jīng)濟(jì)條件的改善，衛(wèi)生設(shè)施的完善，絮狀表皮癬菌的流行分布、易感人群等特征較前已發(fā)生了變化。隨著基因組學(xué)的研究，以前未被發(fā)現(xiàn)的基因缺陷或者突變與宿主易感性也有重要的相關(guān)性。因此有關(guān)絮狀表皮癬菌的基礎(chǔ)和臨床研究已發(fā)生了較大的變化。

1 基礎(chǔ)研究

1.1 分子生物學(xué)研究

對皮膚癬菌的鑒別和分析，傳統(tǒng)的方法是基于菌落的形態(tài)學(xué)特征，絮狀表皮癬菌的培養(yǎng)可在17 d內(nèi)完成[3]。為了縮短檢驗(yàn)的時(shí)間，提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，基于核苷酸序列的方法已用來鑒別皮膚癬菌[4,5]。劉昕等[6]對任意聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、巢式PCR、多引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等鑒別皮膚癬菌的方法已進(jìn)行系統(tǒng)綜述，本文著重論述有關(guān)絮狀表皮癬菌近幾年來分子生物學(xué)鑒別的研究進(jìn)展。

自Makimura等[7]于1999年提出用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)來鑒別皮膚癬菌以來，這種方法目前已被許多實(shí)驗(yàn)室所采用。但近年研究者提出ITS序列不能將部分在生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)上有差異的菌區(qū)別開來，如須癬毛癬菌與趾間毛癬菌[8]，越來越多的研究者傾向依據(jù)ITS序列、菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性、親人或動(dòng)物等特性來綜合判斷[9]。Normand等[10]對292株臨床來源的皮膚癬菌進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增，將所得序列與5大DNA數(shù)據(jù)庫(NCBI、CBS、ISHAM、FunBold、UNITE)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)幾大數(shù)據(jù)庫之間存在不一致的情況，比對結(jié)果差異性多存在于毛癬菌屬，而表皮癬菌屬和小孢子菌屬比對一致性較高。也有研究者利用其他DNA標(biāo)記如D1/D2、延長因子(TEF1)、β-tubulin(BT2)等來鑒別包括絮狀表皮在內(nèi)的皮膚癬菌，研究者們多認(rèn)為單個(gè)基因不足以完全界定各菌種間的關(guān)系，需要綜合多因素考慮[11]。

實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)方法具有污染風(fēng)險(xiǎn)小、不需后續(xù)處理等優(yōu)點(diǎn)，Sherman[12]等設(shè)計(jì)了針對絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌的引物和探針，提取臨床樣本如皮屑、甲屑、頭發(fā)的真菌DNA后在同一體系中進(jìn)行多重RT-PCR試驗(yàn)，并將結(jié)果與傳統(tǒng)如鏡檢、培養(yǎng)等方法進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)多重RT-PCR比傳統(tǒng)方法的檢出率明顯提高，反應(yīng)可在4h內(nèi)結(jié)束，一次實(shí)驗(yàn)便可以完成對44種臨床樣本的鑒定。Motamedi等[13]通過兩種方法對比發(fā)現(xiàn)RT-PCR對皮膚來源樣本的準(zhǔn)確率要高于來源于甲的樣本，存在一定的假陽性率和假陰性率，故認(rèn)為RT-PCR方法在臨床上尚不能完全取代傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法。

Ahmadi等[14]通過對鈣調(diào)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌和親土的庫克小孢子菌組成同一類群(自展值為100%)，說明了絮狀表皮癬菌和小孢子菌屬有密切的聯(lián)系。Garcia等[15]通過擴(kuò)增皮膚癬菌PRP8蛋白內(nèi)含子序列成功地將絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、阿耶洛毛癬菌、奧杜盎小孢子菌等鑒別。同時(shí)通過對歸巢內(nèi)切酶(HE)區(qū)域及dS/dN比值的分析證實(shí)了絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌為同一個(gè)起源的可能性。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是一種高靈敏度和特異性的光譜學(xué)方法。目前已有研究者將此法應(yīng)用于曲霉和酵母菌的研究[16]，Witkowska等[17]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜聯(lián)合主成分分析(SERS-PCA)的方法實(shí)現(xiàn)了對絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等皮膚癬菌的鑒別，總體準(zhǔn)確率為98%。與MOLDI-TOF相比，SERS具有價(jià)格便宜，不受培養(yǎng)條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上可能具有更大的應(yīng)用前景。

1.2 致病機(jī)制

皮膚癬菌最重要的特征為產(chǎn)生蛋白酶分解角蛋白，其感染過程包括黏附、出芽、產(chǎn)生菌絲、侵襲等階段。研究表明絮狀表皮癬菌與紅色毛癬菌等在頭發(fā)作為誘導(dǎo)物的時(shí)候，絮狀表皮癬菌分泌的蛋白酶活性要低于紅色毛癬菌等引起毛發(fā)感染的皮膚癬菌，解釋了為什么絮狀表皮癬菌不引起頭發(fā)感染的部分原因[18]。在底物不同的時(shí)候，皮膚癬菌也能產(chǎn)生磷脂酶磷脂酶、白明膠酶和彈性蛋白酶，這些都被證實(shí)與其致病性相關(guān)[19]。

由于缺乏可靠的皮膚癬菌感染模型，其具體致病機(jī)制到目前尚未研究透徹。固有免疫在皮膚癬菌感染中的作用已被證實(shí)，近年來研究者們主要探討適應(yīng)性免疫在真菌感染中的作用。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在臨床痊愈和預(yù)防再感染均有重要作用，其中CD4+T淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體抵抗皮膚癬菌感染的最重要成分[20]。Heinen等[21]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCR介導(dǎo)的免疫是控制皮膚癬菌感染的關(guān)鍵。Th1和Th17在適應(yīng)性免疫中起到了重要的作用，Th17主要作用為清除病原真菌，Th1在病原菌清除和下調(diào)Th17誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中均起作用。Heinen等[20]認(rèn)為Th17信號(hào)通路的激活和IL-17的合成也有可能是機(jī)體固有免疫的一部分。

雖然皮膚癬菌多引起淺表感染，但能夠引發(fā)宿主復(fù)雜的免疫反應(yīng)，炎癥因子在致病過程中也起到了重要的作用，且其種類及量不同影響了患者的臨床表現(xiàn)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)親人性皮膚癬菌如絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌等主要誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β等細(xì)胞因子，引起的炎癥反應(yīng)相對較輕。而親動(dòng)物性皮膚癬菌如犬小孢子菌等除了誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子外，還能刺激IL-10、IL-2、IL-15、TGF-β等的產(chǎn)生，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[22]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在炎癥介質(zhì)的刺激下產(chǎn)生，在組織的修復(fù)中具有重要作用，Warner等[23]認(rèn)為MMP-9可以作為急性炎癥的一個(gè)分子標(biāo)記。Kitisin等[24]研究了絮狀表皮癬菌在感染人包皮成纖維細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)在MMP-9抑制劑SB-3CT存在的條件下MMP-9的分泌有所減少，包皮成纖維細(xì)胞的活性相應(yīng)地有所改善，因此在一定程度上減少M(fèi)MP-9的分泌可以保護(hù)組織細(xì)胞免受絮狀表皮癬菌的感染。

對于人類而言，表皮屏障受損如皮膚劃傷、甲改變、青春期皮脂腺未完全發(fā)育等，以及環(huán)境濕度的增加均是皮膚癬菌容易感染的因素[25]。糖尿病患者皮膚癬菌感染率為正常人感染的3倍，尤其以足癬和甲癬多見[9]。

1.3 基因組學(xué)研究

線粒體DNA在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)均有大量的拷貝，具有保守區(qū)和可變區(qū)，可以作為分子標(biāo)記來以利于研究種群的結(jié)構(gòu)及其多樣性[26]。如前所述利用單個(gè)基因來進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析容易出現(xiàn)差錯(cuò)，而線粒體基因組則可以避免這種偏移。Tambor等[26]報(bào)道了絮狀表皮癬菌線粒體基因組序列(30.9kb)，并與紅色毛癬菌、構(gòu)巢曲霉、馬爾尼菲籃狀菌的線粒體基因組進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌和紅色毛癬菌具有高度的相似性，所得結(jié)論與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育具有一致性。Wu等[27]進(jìn)一步對絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等皮膚癬菌的線粒體基因組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)6種菌的線粒體基因組具有相同的排列順序，通過系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌的分化要晚于其他致病真菌，并進(jìn)一步證明了皮膚癬菌內(nèi)部在進(jìn)化上具有緊密聯(lián)系，但是線粒體基因組分析未能說明絮狀表皮癬菌和其他皮膚癬菌在進(jìn)化上的相互關(guān)系。

自20世紀(jì)90年代以來，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌感染具有一定的宿主遺傳易感性[28]。Ferwerda等[29]發(fā)現(xiàn)患者CLEC7A基因的突變，能夠影響與真菌β-葡聚糖結(jié)合的Dectin-1蛋白的生成，從而影響宿主對病原真菌的識(shí)別過程。Jaradat等[30]發(fā)現(xiàn)編碼抗微生物肽β防御素-2的DEFB4基因拷貝數(shù)下降的時(shí)候，宿主對皮膚癬菌的敏感性增加；且皮膚癬菌病患者基因組中DEFB4拷貝數(shù)要顯著低于健康對照組，血清hBD-2、IL-22水平要高于對照組，表明基因和細(xì)胞因子的相互作用在皮膚癬菌的感染中也起到了一定的作用。

宿主抗真菌免疫應(yīng)答通路的突變?nèi)鏑ARD9、STAT3等已有報(bào)道[31]。Vaezi等[32]總結(jié)了既往報(bào)道的由CARD9缺陷導(dǎo)致的真菌感染病例，對發(fā)病率、地域分布及突變類型進(jìn)行分析，亞洲因人口眾多，CARD9突變率要高于非洲及其他國家，CARD9突變類型可能也具有一定的地域性，所有60例突變患者中，皮膚癬菌感染者占37.3%，尚未見絮狀表皮癬菌感染的報(bào)道。

2 臨床研究

2.1 流行現(xiàn)狀

皮膚癬菌病近年來有上升趨勢，其發(fā)病率與氣候、經(jīng)濟(jì)條件及性別年齡等均有很大的關(guān)系。Zhan等[1]報(bào)道近100年以來，皮膚癬菌的分布也發(fā)生了較大的變化，絮狀表皮癬菌、許蘭毛癬菌、奧杜盎氏小孢子菌、鐵銹色小孢子菌發(fā)病率有所下降，目前多見于發(fā)展中國家。Zamani等[33]對伊朗德黑蘭某真菌科2010至2014年間皮膚癬菌感染患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明絮狀表皮癬菌發(fā)病率位列第一(31%)，紅色毛癬菌(26.2%)和須癬毛癬菌(20.3%)次之。Nweze等[34]和Coulibaly等[35]對非洲皮膚癬菌病進(jìn)行系統(tǒng)回顧，其發(fā)病率可高達(dá)95%，致病菌的分布有地域和感染部位的差異，總體而言絮狀表皮癬菌在體癬中發(fā)病率最高達(dá)16%，而在甲癬中的發(fā)病率最高為9%。而在相對發(fā)達(dá)的希臘克里特島和巴西，Didehdar等[36]和Heidrich等[37]報(bào)道絮狀表皮癬菌的發(fā)病率分別為2.5%和1.5%，次于紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和犬小孢子菌的發(fā)病率。說明絮狀表皮癬菌的感染與經(jīng)濟(jì)條件、衛(wèi)生狀況等關(guān)系密切。

2.2 治 療

目前唑類和特比萘芬為治療嚴(yán)重皮膚癬菌感染的常用藥物。Badali等[38]對臨床分離的57株毛癬菌和11株絮狀表皮癬菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，藥物主要包括兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈。結(jié)果表明對于絮狀表皮癬菌，特比萘芬的MIC值最低(0.03mg/L)，除伏立康唑外，其余的藥均有一定的抗菌作用。傳統(tǒng)抗真菌藥作用靶點(diǎn)有限，雖然皮膚癬菌耐藥少見，但是隨著真菌的代償性應(yīng)激反應(yīng)，參與藥物外排、細(xì)胞解毒的基因過表達(dá)、編碼靶酶的基因突變等均可能引起藥物耐受[39]?，F(xiàn)已有研究作用于新的靶點(diǎn)的抗真菌藥，如抑制乙醛酸循環(huán)、嘧啶合成、細(xì)胞色素P450途徑、鐵代謝等代謝通路，以及在表觀遺傳學(xué)水平抑制轉(zhuǎn)錄因子等[40]，但這些藥物試驗(yàn)主要集中于隱球菌、曲霉、念珠菌等能引起系統(tǒng)感染的菌種，有關(guān)皮膚癬菌的臨床試驗(yàn)較少。

VT-1161為一種新型的細(xì)胞色素P450依賴酶-14α-羊毛脂醇脫甲基酶(cyp51)抑制劑，當(dāng)藥物濃度<1 nmol/L時(shí)能夠選擇性作用于真菌的CYP51[41]。Garvey等[42]報(bào)道了VT-1161體外抗皮膚癬菌活性，其中在絮狀表皮癬菌中VT-1161的MIC值(<0.016～0.03 μg/mL)要低于伊曲康唑(0.03～0.12 μg/mL)。且VT-1161半衰期較長，每周一次給藥可以達(dá)到與每日給藥一次相近的血漿及皮膚的藥物濃度，被認(rèn)為比伊曲康唑服用更加方便。

姜黃素不僅是一種安全可食用的香料，其作為一種光敏性物質(zhì)在抗菌方面的作用也逐漸被發(fā)掘[43]。Brasch等[44]在體外觀察光動(dòng)力聯(lián)合姜黃素對皮膚癬菌包括絮狀表皮癬菌生長的影響。結(jié)果表明絮狀表皮癬菌對姜黃素最敏感，僅用0.2 μg/mL的姜黃素即可檢測到明顯的抑制作用，對其余皮膚癬菌如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌等的抑制濃度為0.6 μg/mL，但其抑制機(jī)制目前尚未闡明。

外用抗真菌藥難以滲透甲板，因此甲癬治療較體癬、股癬要困難，復(fù)發(fā)率高，往往需要聯(lián)合口服藥物才能達(dá)到治療效果。NO具有擴(kuò)張血管、傳遞神經(jīng)信號(hào)、促進(jìn)傷口愈合等作用，NO在抵抗病原微生物的先天性免疫中也起到了一定的作用[45]。NVN1000為一種可以穩(wěn)定提供治療劑量NO的聚硅氧烷分子。Stasko等[46]研究發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌對NVN1000敏感，在2mg/mL的NVN1000(302 μg/mL NO)的作用下，4 h后99.9%的真菌被抑制。NO及其相關(guān)氣體能夠快速通過甲板和微生物脂膜，為臨床高效地局部治療甲真菌病提供了一種有效地方法。

Zhang等[47]經(jīng)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)特比萘芬或聯(lián)苯芐唑聯(lián)合他克莫司時(shí)在抑制絮狀表皮癬菌時(shí)具有協(xié)同作用，但是在聯(lián)合曲安奈德時(shí)則沒有類似作用。此外也有研究者報(bào)道次級地衣化合物如地衣酸[48]、百香油[49]等對絮狀表皮癬菌也有抑制作用。

3 小 結(jié)

隨著經(jīng)濟(jì)條件的改善，皮膚癬菌的流行情況不斷發(fā)生著變化，絮狀表皮癬菌的發(fā)病率較前已有所下降，但是在發(fā)展中國家如非洲等發(fā)病率仍可高達(dá)95%，需引起我們的注意。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了新的檢測分類方法及與宿主易感性相關(guān)的基因，為了解其致病機(jī)制和臨床的診治提供了重要的方向。人們對美觀較前有更高的要求，而絮狀表皮癬菌感染皮膚、甲等暴露部位，在一定程度上可給患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)，需要我們臨床醫(yī)生更全面掌握相應(yīng)的臨床及基礎(chǔ)知識(shí)以提供更精細(xì)、針對性的治療。因皮膚癬菌治療療程長及藥物的不良反應(yīng)，患者易忽略或放棄治療，在一定程度上可能誘導(dǎo)耐藥菌的形成，因此針對不同靶點(diǎn)的新藥研發(fā)也具有重大意義。