趙曉琴 馮文莉

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，太原 030001)

白念珠菌常寄居于人體腸道、呼吸道和女性泌尿生殖道的上皮細(xì)胞內(nèi)，屬于人體機(jī)會(huì)性致病真菌，是醫(yī)院獲得性感染的第4個(gè)最主要原因。白念珠菌生存方式包括游離狀態(tài)和生物膜狀態(tài)，生物膜是白念珠菌病理生理學(xué)一個(gè)不可或缺的特征，其最直接的例證就是白念珠菌生物膜形成在醫(yī)療器械感染中的作用。生物膜是由酵母細(xì)胞、菌絲和細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜聯(lián)合體[1]。現(xiàn)有的抗真菌藥物對(duì)游離狀態(tài)下的白念珠菌有效，但對(duì)大多數(shù)生物膜狀態(tài)下的白念珠菌抑制效果較差，這使得基于生物膜感染的治療成為困擾臨床的一大難題。

生物膜是由一組互聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子形成的極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。白念珠菌生物膜主要由Nobile等[2]先前發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子Bcr1 (biofilm and cell wall regulator 1)、Tec1 (transposon enhancement control 1)、Ndt80(yeast meiosis specific transcription factor)、Rob1(Zn(II)2Cys6 transcription factor)、Brg1(GATA-type zinc finger transcription factor)、Efg1(enhanced filamentous growth 1)以及Fox等[3]后來(lái)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子Flo8(FLOcculation 8)、Rfx2(regulatory factors that bind to the X box 2)等調(diào)節(jié)。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子可正性調(diào)節(jié)生物膜形成，只有少數(shù)如Nrg1 (negative regulator of glucose-controlled genes 1)、Tup1(TMP-UPtake 1)、Rfx2等對(duì)生物膜形成產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)的影響。本文主要概述白念珠菌生物膜形成各階段的主要轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步明確白念珠菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制。

1 白念珠菌黏附的調(diào)控

生物膜形成的第一步是細(xì)胞黏附。白念珠菌細(xì)胞壁是與底物或另一細(xì)胞最直接相互作用的結(jié)構(gòu)。其主要由碳水化合物(β-葡聚糖和幾丁質(zhì))和糖蛋白(黏附素)組成，黏附素參與白念珠菌生物膜的黏附。

1.1 轉(zhuǎn)錄因子正性調(diào)節(jié)黏附

目前主要的黏附素為細(xì)胞壁蛋白，如Als家族，Eap1、Hwp1和Rbt1[4]。研究證明各種細(xì)胞壁蛋白均受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Bcr1在白念珠菌細(xì)胞黏附中起主要作用。一方面，Bcr1通過(guò)調(diào)控下游靶基因ALS1表達(dá)促進(jìn)白念珠菌細(xì)胞-底物(硅氧烷)黏附；另一方面，Bcr1通過(guò)調(diào)控下游靶基因ALS1、ALS3、ECE1和HWP1的表達(dá)介導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞-細(xì)胞黏附[5]。Efg1是真菌界獨(dú)有的APSES轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可調(diào)控下游黏附基因HWP1、ALS1和EAP1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞黏附。而對(duì)雷帕霉素敏感的蛋白激酶Tor1通過(guò)控制Bcr1和Efg1的活性負(fù)性調(diào)控白念珠菌細(xì)胞-細(xì)胞黏附[6]。Tec1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TEA / ATTS家族的一部分，Daniels[7]研究發(fā)現(xiàn)，TEC1/TEC1突變體能夠在硅氧烷彈性體上黏附，但黏附性略低。另外，Tec1、Efg1、Ndt80和Brg1均可結(jié)合ALS1啟動(dòng)子[8]，促進(jìn)白念珠菌黏附，但均不是黏附階段的主要調(diào)控因子，僅起輔助作用。

1.2 轉(zhuǎn)錄因子負(fù)性調(diào)節(jié)黏附

轉(zhuǎn)錄因子Rfx2、Sfp1和Zcf32可抑制白念珠菌的細(xì)胞黏附。

Hao等[9]研究表明，RFX2缺失突變體在固體培養(yǎng)基上可促進(jìn)HWP1、ALS3基因表達(dá)增加，白念珠菌細(xì)胞黏附增加。C2H2轉(zhuǎn)錄因子Sfp1，參與核糖體基因的表達(dá)，通過(guò)Rhb1-TOR-Sfp1-Bcr1/Efg1信號(hào)傳導(dǎo)途徑起作用，Sfp1抑制Bcr1/Efg1介導(dǎo)的ALS1、ALS3和HWP1黏附素基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制生物膜的形成[10]。Zcf32是最新發(fā)現(xiàn)的Zn(II)2 Cys6雙核簇轉(zhuǎn)錄因子成員，其通過(guò)抑制黏附調(diào)節(jié)劑Try5和屬于Hwp黏附素家族的許多細(xì)胞壁蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)黏附步驟，在ZCF32突變體中觀察到屬于Hwp家族的黏附素如CHT2、PGA38、RBT5和SAP4高表達(dá)[11]，且RBT5在BCR1Δ/BCR1Δ突變體中高度表達(dá)可部分彌補(bǔ)生物膜起始缺陷，表明其可能在黏附中發(fā)揮作用。

由此可見(jiàn)，正負(fù)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黏附階段的調(diào)控均是基于對(duì)靶黏附基因的調(diào)控發(fā)揮作用的，轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)或抑制一個(gè)或多個(gè)黏附基因的表達(dá)進(jìn)而影響白念珠菌的黏附及生物膜的形成，大部分轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黏附階段的調(diào)控與轉(zhuǎn)錄因子Bcr1有關(guān)。

2 酵母相-菌絲相的轉(zhuǎn)換

菌絲和酵母細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)換，缺乏從一種形式轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式能力的突變體形成有缺陷的生物膜。白念珠菌菌絲的形成主要受兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制：環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A(cAMP-protein kinase A,cAMP/PKA)途徑和有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑。

2.1 促進(jìn)菌絲發(fā)展的因子

cAMP/PKA途徑下游發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子有Efg1、Tec1、Bcr1、Flo8。EFG1高表達(dá)可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)錄因子Tec1位于Efg1下游，受Efg1轉(zhuǎn)錄調(diào)控，TEC1純合缺失突變體菌絲發(fā)育受阻[12]。而Tec1則控制生物膜調(diào)節(jié)因子BCR1的表達(dá)，BCR1可以促進(jìn)菌絲相關(guān)基因的表達(dá)，但不是菌絲生長(zhǎng)所必需的。含有LisH結(jié)構(gòu)域的Flo8也是菌絲生長(zhǎng)所必需的[13]，F(xiàn)lo8位于Efg1下游，F(xiàn)ox等[3]發(fā)現(xiàn)Ndt80和Efg1均可調(diào)控Flo8，F(xiàn)lo8對(duì)Ndt80、Efg1也有一定制約作用。另外，F(xiàn)LO8Δ/Δ突變體在大鼠體內(nèi)中心靜脈導(dǎo)管模型中形成的生物膜高度缺陷，其毒力也明顯減弱。

cAMP/PKA途徑上游發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子是Ndt80，其在真菌中高度保守，NDT80缺失突變體在血清或GlcNAc中顯示出菌絲形成缺陷明顯，這與Ndt80調(diào)節(jié)RAS1的表達(dá)能力有關(guān)[14]。而Sellam等[15]研究發(fā)現(xiàn)Ndt80能促進(jìn)菌絲特異性基因UME6和TEC1的表達(dá)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。Ume6(白念珠菌菌絲發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子)通過(guò)Hgc1和Sun41機(jī)制增強(qiáng)生物膜形成[16]，缺失Hgc1(細(xì)胞周期蛋白相關(guān)蛋白)和Sun41(細(xì)胞壁糖苷酶)，Ume6介導(dǎo)的生物膜形成減少。另外，在菌絲形成期間NDT80突變體未能下調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制因子Nrg1[15]，這表明Ndt80是白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換中轉(zhuǎn)錄基因激活和抑制所必需的。

MAPK途徑中的轉(zhuǎn)錄因子有Tec1和GATA型鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Brg1(又稱(chēng)Gat2)，Brg1在Tec1下游起作用，BRG1/BRG1突變體不能在塑料和硅樹(shù)脂表面形成生物膜，其過(guò)表達(dá)在Lee's培養(yǎng)基上促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，而該基因的缺失具有相反的效果。然而，BRG1的失活對(duì)GlcNAc誘導(dǎo)的菌絲發(fā)育沒(méi)有明顯影響。在全身感染的小鼠模型中，BRG1/BRG1突變體明顯減弱其毒力[17]。最近Su等[18]研究發(fā)現(xiàn)BRG1表達(dá)增加可以抑制NRG1表達(dá)，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

Glazier等[19]研究表明，Rob1在菌絲形成的起始階段起作用，并且Tec1、Efg1和Ndt80與ROB1的上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，它們與ROB1的啟動(dòng)子結(jié)合但并不明顯影響ROB1表達(dá)，表明ROB1的表達(dá)依賴(lài)于Rob1對(duì)其自身表達(dá)的自我調(diào)節(jié)功能。

上述轉(zhuǎn)錄因子Tec1、Efg1、Ndt8、Rob1、Brg1、Bcr1與BCR1、TEC1、EFG1、BRG1的上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，Tec1、Efg1、Ndt80、Rob1與ROB1的上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，Efg1、Ndt80與NDT80上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，共同調(diào)控菌絲和生物膜發(fā)育。另外，參與菌絲生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)影響白念珠菌毒力，白念珠菌生物膜形成及其毒力增加導(dǎo)致白念珠菌耐藥更加嚴(yán)重。

2.2 抑制菌絲發(fā)展的因子

Nrg1、Rfg1和Tup1是白念珠菌菌絲生長(zhǎng)的三個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子。

Tup1是一種通用的轉(zhuǎn)錄抑制因子，必須通過(guò)與各種共抑制因子，特別是DNA結(jié)合蛋白如Nrg1p的相互作用而進(jìn)入其作用位點(diǎn)。缺乏TUP1的菌株在酵母相和誘導(dǎo)菌絲的條件下都生長(zhǎng)為假菌絲，并且在系統(tǒng)感染小鼠模型中顯示毒力減弱[20]。鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Nrg1被認(rèn)為通過(guò)將Tup1募集到靶基因的啟動(dòng)子上起作用，其可抑制BRG1、BCR1的表達(dá)抑制菌絲形成，導(dǎo)致生物膜形成減少[21]。NRG1高表達(dá)顯示阻斷酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)變，在小鼠模型中白念珠菌毒力明顯減弱。Rfg1是具有HMG抑制結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白，白念珠菌中RFG1基因的缺失促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，而RFG1的高表達(dá)不會(huì)在體外或體內(nèi)抑制菌絲形成[22]。Tup1可通過(guò)Nrg1和Rfg1一起或獨(dú)立抑制菌絲的生長(zhǎng)。

3 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生

成熟的白念珠菌生物膜被包裹在ECM中，該基質(zhì)是糖蛋白，碳水化合物(主要是α-甘露聚糖，β-1,6-葡聚糖多糖及β-1,3-葡聚糖的混合物)，脂質(zhì)和核酸的混合物。ECM可促進(jìn)細(xì)胞間黏附，減少細(xì)胞分散，避免細(xì)胞受免疫系統(tǒng)攻擊以及抵抗抗真菌藥物進(jìn)入細(xì)胞。目前對(duì)ECM的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生知之甚少，鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Zap1和Rlm1參與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控。

RLM1的缺失可通過(guò)下調(diào)Gsc1(也稱(chēng)為Fks1)β-1,3-葡聚糖合酶亞基來(lái)減少基質(zhì)形成，促進(jìn)β-1,3-葡聚糖的形成。編碼產(chǎn)生基質(zhì)多糖成分酶的基因突變(參與甘露聚糖合成的ALG11、MNN4-4、MNN9、MNN1、PMR1、VAN1和VRG4，參與β-1,6-葡聚糖合成的BIG1和KRE5，以及參與β-1,3-葡聚糖合成的GSC1)導(dǎo)致基質(zhì)合成廣泛缺陷[23]，這突出了它們?cè)诨|(zhì)和生物膜發(fā)展的生產(chǎn)中的關(guān)鍵作用。Zap1為基質(zhì)β-1,3葡聚糖的負(fù)調(diào)節(jié)劑，敲除ZAP1基因，顯示細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，其靶標(biāo)包括直接作用于基質(zhì)多糖的葡糖淀粉酶(Gca1和Gca2)和起間接起作用的醇脫氫酶(Csh1、Ifd6和Adh5)[24]。

4 細(xì)胞分散的調(diào)控

白念珠菌生物膜內(nèi)的細(xì)胞分散到環(huán)境中是生物膜生命周期中的另一個(gè)重要階段。生物膜中分散的細(xì)胞是源自生物膜最頂端的菌絲層的酵母細(xì)胞。與浮游細(xì)胞相比，這些生物膜分散的酵母細(xì)胞顯示出黏附性增加，更具有形成生物膜的能力以及在小鼠感染模型中毒力增強(qiáng)[25]。生物膜分散的主要轉(zhuǎn)錄因子包括Nrg1、Pes1(也稱(chēng)為Nop7，參與反向形態(tài)轉(zhuǎn)變)和Ume6。

NRG1和PES1的高表達(dá)增加了生物膜細(xì)胞釋放的數(shù)量，而UME6的高表達(dá)減少了分散。PES1作用于NRG1的下游，用于分散細(xì)胞的產(chǎn)生，但不影響菌絲形態(tài)或生物膜結(jié)構(gòu)，其高表達(dá)導(dǎo)致生物膜細(xì)胞分散和播散感染增強(qiáng)[26]。此外，研究表明，任何有利于酵母細(xì)胞向菌絲轉(zhuǎn)變的因子都可能減少生物膜細(xì)胞的分散。分子伴侶Hsp90消耗顯著減少了生物膜中分散細(xì)胞的數(shù)量[27]。Ywp1(酵母細(xì)胞壁蛋白1)也對(duì)生物膜分散很重要，缺失YWP1導(dǎo)致降低生物膜分散和增加生物膜黏合性[28]。

綜上所述，白念珠菌生物膜形成受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，某些轉(zhuǎn)錄因子影響生物膜形成的多個(gè)階段，如Efg1、Tec1、Bcr1和Rfx2在白念珠菌黏附和菌絲的形成階段均發(fā)揮作用，Ume6、Nrg1在白念珠黏附、菌絲形成和分散中發(fā)揮作用。盡管轉(zhuǎn)錄因子可能在多個(gè)階段發(fā)揮作用，但在某一階段主要由部分轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮主要作用，其他轉(zhuǎn)錄因子輔助完成該階段，共同調(diào)控生物膜的形成。目前對(duì)白念珠菌生物膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及抗真菌藥靶點(diǎn)的研究以黏附和菌絲形成階段多見(jiàn)，對(duì)于成熟生物膜的后續(xù)發(fā)展，細(xì)胞外基質(zhì)的形成，酵母細(xì)胞分散的研究較少，因此未來(lái)可能會(huì)集中于對(duì)生物膜形成后面兩個(gè)階段的研究，以期為治療白念珠菌耐藥尋找更多的靶點(diǎn)。