楊笑敏 王俊娟 王德龍 陸許可 陳修貴 郭麗雪 王帥 陳超王曉歌 韓明格 葉武威
(中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點開放實驗室,安陽 455000)
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)在DNA甲基轉移酶的催化下把甲基(-CH3)轉移到DNA分子中特定堿基上的過程稱為DNA甲基化的過程[1]。多數(shù)發(fā)生在CpG島的胞嘧啶第5位碳原子(C5)上,通常發(fā)生在對稱序列CG中,但是在CHG和CHH(H=A、C或T)序列中也有發(fā)生[2]。DNA甲基化是一種廣泛存在的表觀遺傳過程,包括轉座子的抑制、基因組印記[3]、X染色體失活[4]、細胞分化[5]和胚胎發(fā)育[6]。在脅迫條件下植物通過DNA甲基化過程,誘導一些與抗逆相關的基因表達,增強植物的抗逆性,維持植物的生長發(fā)育和進化過程[7]。DNA甲基化是一種植物響應逆境脅迫的分子機制[8]。植物中存在2種DNA甲基化方式:一種是維持甲基化(Maintenance methylation),通過半保留復制把雙鏈DNA分子的一條鏈存在甲基化,另一條鏈沒被甲基化的親代甲基化模式傳遞給子代[9];另一種是從頭甲基化(De novomethylation),通過不同的DNA甲基轉移酶催化將不存在甲基化的DNA雙鏈形成甲基化[10]。植物中的C5-DNA甲基轉移酶有4種,維持DNA甲基轉移酶(Methyltransferase,MET)家族[11];染色質甲基化酶(Chromomethylase,CMT)家族[12];Dnmt2;結構域重排甲基轉移酶(Domains rearranged methyltransferase,DRM)家族可以在RNA指導下,催化胞嘧啶從頭甲基化,以及維持非CpG位點的甲基化[13];MET、CMT與動物的DNMT1 為同源[14];DRM 與動物的 DNMT3 同源[15]。
非生物脅迫嚴重影響和制約著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質。當煙草發(fā)生滲透脅迫時(NicotianaL.)組織培養(yǎng)細胞的異染色質區(qū)會發(fā)生DNA超甲基化[16]。CHROMOMETHYLASE3(SLCMT3)基因可以使Chr番茄果實的成熟,提高控制成熟關鍵基因的表達[17];當蘿卜(Raphanus sativusL.)受到重金屬鉻脅迫時DNA的甲基化水平會升高[18];玉米(Zea maysL.)受到冷脅迫時,根系通過降低核小體中心DNA甲基化水平誘導ZmMI1表達,受到鹽脅迫時玉米幼苗zmPP2C甲基化將下調和zmGST表達量也下調[19];大豆受干旱、冷、鹽脅迫時,根中CaDRM1和CaDRM2的表達量上調,以應對脅迫壓力[20];苜蓿種子發(fā)育和結瘤的早期階段MtDRM1和MtDRM2高度表達,MtDRM3在種子和結節(jié)發(fā)育階段表達量高[20]。DNA甲基轉移酶與抗逆性密切相關,深入對DNA甲基轉移酶的作用機制進行研究,對進一步挖掘抗逆基因具有重要意義。
棉花作為重要的經(jīng)濟作物,其棉纖維可以制作成織物,棉籽可以榨油,在人們的日常生活中應用廣泛。脅迫條件下,棉花產(chǎn)量會大幅度減產(chǎn);DNA甲基轉移酶可以增強植物的耐受性,GhDMT3是DRM家族的一員,在水稻中鑒定出2個DRM家族相關基因、苜蓿中鑒定出4個DRM家族的成員、在大豆中發(fā)現(xiàn)5個DRM家族相關基因、在玉米和擬南芥中各含有2個DRM家族的成員,而棉花中的DNA甲基轉移酶研究較少。本研究通過對棉花GhDMT3進行生物信息學分析,并構建pYL156:GhDMT3沉默載體,對其進行功能驗證,為提高棉花抗逆性奠定基礎。
陸地棉TM-1由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所品種資源研究室保存。所用菌種為大腸桿菌E.coliDH5α,農(nóng)桿菌 LB3101、pYL156、pYL192(輔助載體)和pYL156:GhDMT3(陽性對照載體)載體由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所基因組測序課題組提供。
1.2.1 RNA的提取及cDNA的制備 按照北京艾德萊生物科技的RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書提取RNA,按照北京全式金的TransScript ΙΙ All-in -One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal) 說明書制備cDNA。
1.2.2GhDMT3的克隆 用Primer Premier 5軟件設計GhDMT3引物(F:ATGGTTGACAATAATTCGGGTGG;R:TCAGATAATCATTGATTTTGTG),以cDNA為模板進行擴增,PCR程序為94℃ 5 min;94℃20 s,54℃ 20 s,72℃ 70s,34 個循環(huán);72℃ 10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,回收、純化,與T載連接,并轉入E.coliDH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性單克隆并測序,獲得正確的t-GhDMT3序列。
1.2.3 構建pYL156:GhDMT3的VIGS載體 用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切PYL156,獲得線性pYL156載體,以克隆載體t-GhDMT3為模板用引物in-VGhDMT3進行擴增,獲得VIGS片段。用in-FuSion技術將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到線性的PYL156載體上,轉入大腸桿菌,挑取陽性單克隆測序,獲得正確的單克隆,并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗證,成功構建pYL156:GhDMT3載體。
1.2.4 pYL156:GhDMT3的VIGS沉默及表達量檢測 種植TM-1到兩片子葉平展時,用一次性的醫(yī)用注射器在葉片的背面,進行VIGS注射,注射面積在75%以上。然后置于25℃黑暗培養(yǎng)24 h,處理結束后,在適宜的溫度(28℃ 14 h/25℃ 10 h)下保證幼苗正常生長。當出現(xiàn)白化后,對植株分別進行冷(4℃)和干旱(自然干旱)處理,當與對照出現(xiàn)表型差異時,測定GhDMT3的相對表達量。
通過ExPASY網(wǎng)站的生物軟件ProtParam程序對GhDMT3編碼的蛋白進行組分分析,該蛋白質相對分子質量為71 107.02 kD,等電點為4.85,該基因編碼的蛋白質分子式為C3151H4897N849O981S23,共計9 901個原子,編碼640個氨基酸,其中65個帶正電的氨基酸(Arg +Lys),96個帶負電的氨基酸(Asp+Glu),不穩(wěn)定系數(shù)為36.33,脂肪系數(shù)為81.81,總平均親水性為-0.364,預測該蛋白為酸性蛋白,不含有賴氨酸和絲氨酸,色氨酸含量最低為1.6%,亮氨酸含量最高為10.2%。
圖1 GhDMT3蛋白的疏水性/親水性檢測
利用ProtScale網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的親疏水性進行預測,結果(圖1)表明,在256位的S親水性最強分值為-2.357,在517位的F疏水性最強分值為1.210,親水性總平均值為-1.157,推測該基因的整個氨基酸序列中親水性氨基酸比疏水性氨基酸多,所以該蛋白為親水性蛋白。綜上所述,該基因編碼的蛋白具有一定的親水能力但不穩(wěn)定。
通過TMHMM網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的跨膜結構域進行分析(圖2),GhDMT3蛋白不存在跨膜結構域,屬于非跨膜蛋白,與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結果基本一致。利用SignalP-4.0網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的信號肽預測結果為C值(剪切位點)為0.114,S值(信號肽)為0.109,Y值(綜合剪切點)為0.105(圖3)。GhDMT3蛋白并不是分泌型蛋白,不在細胞中發(fā)生遷移。
圖2 GhDMT3蛋白的跨膜結構域分析
圖3 GhDMT3蛋白的信號肽預測
圖4 GhDMT3基因編碼蛋白的二級結構
通過軟件預測分析GhDMT3蛋白的二級結構。結果(圖4)表明,無規(guī)則卷曲包含298個氨基酸殘基,占46.56%,α螺旋包含266個氨基酸殘基,占41.11%,延伸鏈包含67個氨基酸殘基,占10.47%,β-轉角包含33個氨基酸,占5.12%。
使用軟件SWISS-MODEL預測GhDMT3蛋白的三維結構,GhDMT3蛋白三維結構以α螺旋為主(圖5),符合GhDMT3蛋白的二級結構分析。
圖5 GhDMT3蛋白的三級結構
利用RT-PCR技術擴增GhDMT3,轉T載體,獲得t-GhDMT3;以克隆載體t-GhDMT3為模板,對in-v-GhDMT3進行擴增,獲得VIGS片段(圖6-A)。用in-FuSion技術將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到pYL156載體上,并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗證(圖6-B),即成功構建pYL156:GhDMT3載體。
圖6 VIGS載體pYL156:GhDMT3的構建與驗證
VIGS侵染棉花植株15 d左右,陽性植株葉片白化明顯,其他正常生長,用沒有侵染的棉花和用pYL156侵染的棉花作對照,對沉默植株進行冷、干旱的脅迫處理。冷處理36 h后植株表型差異明顯(圖7-A),注射pYL156的植株與野生型的新生真葉枯萎卷曲,注射pYL156:GhDMT3的植株正常生長,表型變化不明顯。pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達量無顯著變化,與對照相比,用pYL156:GhDMT3侵染過的棉花GhDMT3轉錄水平明顯下降。根部下降最多;莖部次之;葉片下降最少(圖7-B)。
自然干旱6 d后植株表型差異明顯,注射pYL156的植株和野生型的子葉脫落,新生真葉發(fā)黃枯萎,嚴重失水,植株死亡,注射pYL156:GhDMT3的植株真葉沒有枯萎失水現(xiàn)象(圖8-A)。檢測pYL156:GhDMT3侵染過的棉花中GhDMT3的相對表達量,由圖可知pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達量沒有變化,用pYL156:GhDMT3侵染過的棉花中GhDMT3轉錄水平與對照相比葉片中下降最多;莖部次之;根部下降最少(圖8-B)。
圖7 VIGS侵染后的棉花表型和冷脅迫36 h的棉花表型(A);VIGS侵染成功冷脅迫處理后植株的相對表達量(B)
圖8 VIGS侵染后的表型和干旱脅迫6 d的表型(A)及VIGS侵染成功干旱脅迫處理后植株的相對表達量(B)
DNA甲基轉移酶是DNA甲基化過程中的關鍵酶,在擬南芥[10]、水稻[21]、玉米[22]、大豆[20]、葡萄[23]、番茄[24]及蓖麻[25]等植物中鑒定出 DNA 甲基轉移酶。GhDMT3與蓖麻中的DRM家族基因編碼蛋白一致,該家族基因編碼蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白,不具有跨膜結構域,二級結構以無規(guī)則卷曲、α螺旋為主為。通過分析GhDMT3三維結構與DNA甲基轉移酶的典型結構類似,但是有一定的區(qū)別,具體原因需要后續(xù)實驗探明。
大豆的DRM基因在非生物脅迫期間轉錄水平較高參與誘導DNA甲基化改變[20],當擬南芥drm1和drm2雙突變時會造成所有已知模式的胞嘧啶從頭甲基化均有缺失[10],DRM家族基因對于FWA和SUP的基因沉默是重要的,可以通過不同的機制使直接重復和反向重復發(fā)生甲基化[26]。通過沉默GhDMT3基因,證明該基因與抗逆性相關,為明確該基因的功能奠定基礎,而該基因的具體功能需要進一步研究。
成功構建了GhDMT3的VIGS沉默載體,獲得轉基因植株,在冷、干旱脅迫條件下,轉基因植株抵抗力增強。