王焯 羅學(xué)剛 丁翰林 楊昊

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010）

目前世界上對(duì)放射性污染治理采取的主要方法包括物理、化學(xué)和生物修復(fù)。生物修復(fù)以其成本低廉、不產(chǎn)生二次污染而受到許多學(xué)者的關(guān)注。生物修復(fù)主要包括動(dòng)物修復(fù)、植物修復(fù)和微生物修復(fù)。其中植物修復(fù)技術(shù)對(duì)環(huán)境干擾小、操作簡(jiǎn)便、綠色、原位且易于為公眾接受等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前環(huán)境科學(xué)和污染生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1-3］。但單純通過(guò)植物修復(fù)技術(shù)來(lái)促進(jìn)對(duì)放射性核素的吸附富集，雖然從理論上分析可以有效治理鈾污染。但是在放射性污染環(huán)境中植物生長(zhǎng)緩慢，效果不明顯且周期長(zhǎng)。目前多數(shù)對(duì)放射性核素具有超富集的植物基本都存在生物量較低，生長(zhǎng)緩慢，適應(yīng)非原產(chǎn)地土壤環(huán)境較差等問(wèn)題［4］，所以增加植物的生物量、提高植物對(duì)新環(huán)境的抗性或者適應(yīng)性成為植物修復(fù)放射性污染土壤技術(shù)中的關(guān)鍵。

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在重金屬污染的條件下，通過(guò)分泌鐵載體、有機(jī)酸、表面活性劑、固氮酶、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate de-aminase，ACC）、植物生長(zhǎng)激素：3-吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）等物質(zhì)，可以改善植物生長(zhǎng)發(fā)育境況，促進(jìn)植物成長(zhǎng)，增強(qiáng)重金屬脅迫條件下的植物生物量，提高植物修復(fù)的效率［5］。陳可等［6］利用熒光假單胞菌、綠針假單胞菌橙色亞種能明顯促進(jìn)博落回抗干旱能力和對(duì)鈾的富集量。何琳燕等［7］從鎘超積累植物龍葵體內(nèi)和根際土壤中分離篩選到能夠產(chǎn)生IAA的細(xì)菌，能夠明顯增加油菜幼苗根的長(zhǎng)度。李艷梅等［8］從花生根際得到5株耐鎳產(chǎn)鐵載體芽孢桿菌，其中 HSGJ1能有效促進(jìn)花生生長(zhǎng)，增加生物量。Dell’ Amico等［9］從重金屬污染的禾本科牧草中得到的根際促生菌，大部分都表現(xiàn)出 ACC 脫氨酶活性，且都能增加植物生長(zhǎng)。但目前利用放射性污染地區(qū)的植物內(nèi)生菌促進(jìn)植物對(duì)鈾的富集研究還相對(duì)較少。因此，本文擬以某典型鈾尾礦采集的蓼科植物酸模為材料，通過(guò)鈾耐受實(shí)驗(yàn)以及定性定量分析各菌株的植物促生性能，以期分離出對(duì)鈾具有耐受性的植物促生菌，并該菌株接種到苜蓿根部，提高苜蓿的鈾積累量和生物量，為鈾尾礦污染土壤的植物修復(fù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品 供試的酸模植株于2017年10月采自某鈾尾礦區(qū)和附近地區(qū)，將取樣植株和根系附近土壤整體裝入樣品袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步處理。1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：牛肉膏10. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉 5. 0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.0±0.2，于120℃滅菌15 min。鈾篩選培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基加入5 g/L的乙酸雙氧鈾，使培養(yǎng)基中鈾濃度為100 mg/L。King’s培養(yǎng)基：10 mL丙三醇，蛋白胨 20.0 g，磷酸氫二鉀1.5 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.2±0.2，于121℃滅菌15 min。Dworkin and Foster 培養(yǎng)基（DF 培養(yǎng)基）：磷酸氫二鈉 6.0 g，磷酸二氫鉀 4.0 g，硫酸鎂 0.2 g，葡萄糖 2.0 g，葡萄糖酸 2.0 g，檸檬酸 2.0 g，三氧化鉬 10.0 mg，硼酸10.0 mg，硫酸錳 11.2 mg，硫酸銅 78.2 mg，硫酸鋅124.6 mg，硫酸亞鐵100.0 mg，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.0±0.2，于120℃滅菌15 min。ACC篩選培養(yǎng)基：將DF培養(yǎng)基中的硫酸銨替換成ACC。

表1 試驗(yàn)土壤的理化性質(zhì)

1.2 方法

1.2.1 酸模根部耐鈾內(nèi)生菌的分離篩選 將從鈾礦區(qū)采集的的酸模樣品用自來(lái)水清洗干凈后，用去離子水漂洗3次。取樣品健康完整的根部，置于75%的酒精中消毒5 min，在于0.2%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，完成后用去離子水沖洗5遍，同時(shí)取最后一遍的去離子水100 μL，涂布于 LB 固體培養(yǎng)基，以檢測(cè)樣品表面消毒是否徹底。將完成消毒的根系樣品放入無(wú)菌研缽中，加入適量已消毒的石英砂，加入5 mL經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的PBS緩沖液，進(jìn)行研磨。取不同稀釋倍數(shù)的研磨液100 μL涂布于鈾篩選固體培養(yǎng)基中，在30℃下，培養(yǎng)3 d。

1.2.2 內(nèi)生促生菌篩選 采用Salkowski比色法測(cè)定菌株產(chǎn)IAA能力［10］。采用李振東［11］的方法制作比色液和標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)菌株接種到含有100 mg/L色氨酸的LB培養(yǎng)基中，以不含色氨酸的培養(yǎng)基為對(duì)照，在30℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。取6 mL發(fā)酵液在10 000 r/min條件下，離心10 min。取上清液1 mL加入試管中，同時(shí)加入1 mL比色液，15 min觀察顏色變化。將溶液變紅色菌株保留，在取剩下的5 mL上清液，加入5 mL比色液，黑暗下靜止30 min，立即用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD530值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA含量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

上述產(chǎn)IAA菌株的ACC脫氨能力。參照張國(guó)壯［12］的方法，將待測(cè)菌株接種到LB培養(yǎng)基中，25℃，150 r/min下，培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)液，接種到DF培養(yǎng)基中，25℃，150 r/min下，培養(yǎng)24 h。取前一步的培養(yǎng)液1 mL，接種到ADF培養(yǎng)液中，25℃，150 r/min下，培養(yǎng)24 h。取最后一步的培養(yǎng)液100 μL接種到ADF固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3 d，觀察生長(zhǎng)情況。將長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株保留，再次接種到含8 mL含3 mmol/L的ADF液體培養(yǎng)基中，25℃，150 r/min下，培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液在4℃、8 000 r/min下，離心10 min，收集菌體，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.6的Tris-HCl緩沖液，懸浮菌體。在4℃、8 000 r/min下，離心10 min，收集菌體，重復(fù)該步驟3次以除去培養(yǎng)基。向第三次離心得到的菌體中加入1 mL 0.1 mol/L pH=7.6的Tris-HCl緩沖液，混懸后，然后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，16 000 r/min下離心5 min。之后將菌體沉淀再次懸浮于0.6 mL 0.1 mol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液中，加入30 μL甲苯，漩渦振蕩30 s以破碎菌體。吸取0.2 mL破碎細(xì)胞菌懸液，加入20 μL 0.5 mol/L ACC溶液，混勻后于30℃條件下水浴15 min。然后向其中加入1 mL 0.56 mol/L HCl混勻，室溫下16 000 r/min離心5 min。取上述離心上清液1 mL，加入0.8 mL 0.56 mol/L HCl，混勻后再加入0.3 mL 2 g/L的2，4一二硝基苯肼，30℃下水浴30 min。然后，加入2 mL 2 mol/L NaOH顯色，測(cè)定540 nm下測(cè)定其吸光值OD540，以蒸餾水代替菌懸液的處理作為對(duì)照。將樣品的OD540。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到其中α-丁酮酸的含量，計(jì)算每分鐘ACC脫氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的物質(zhì)的量，即單位酶活力U。利用考馬斯亮藍(lán)法以牛血清蛋白為對(duì)照，測(cè)定剩余的菌株懸浮液中蛋白質(zhì)含量（μg）。用單位酶活力除以總蛋白質(zhì)量即為比活力（U/μg），以此表示細(xì)菌的ACC脫氨酶活性。

1.2.3 內(nèi)生菌重金屬抗性實(shí)驗(yàn) 分別挑選1.2.1實(shí)驗(yàn)中的外觀形態(tài)有差異的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁24 h，吸取100 μL擴(kuò)繁培養(yǎng)液接種到含有不同濃度的重金屬LB液體培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d。同時(shí)通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基OD600值確定菌落生長(zhǎng)情況，以此得到每株菌株的耐受最低重金屬濃度即最小抑制濃度（MIC）。其中，鈾質(zhì)量濃度為100、150、200、250、300、350 mg/L，鉛質(zhì)量濃度為200、400、600、800、1 000、1 200 mg/L，錳質(zhì)量濃度為400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg/L，鎳質(zhì)量濃度為25、50、75、100、125、150 mg/L。

1.2.4 內(nèi)生菌的生理生化及分子鑒定 依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)所篩得的菌株D16進(jìn)行初步生理生化試驗(yàn)［13］。目的菌株在 LB 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，肉眼觀察菌落在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。對(duì)菌體用革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。

菌株的DNA 提取參照楊圣［14］的方法。以總DNA 為模板，采用通用引物pA（50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和pC5B（50-TACCTTGTTACGACTT）PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列提取DNA。測(cè)序由成都戴維賽特生物科技有限公司完成。測(cè)序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)用 Blast 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，隨后用MEGA 7. 0軟件、鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行 1 000 次的相似度重復(fù)計(jì)算。

1.2.5 內(nèi)生菌促生特性研究 研究上述篩選的菌株在不同條件下的IAA產(chǎn)量和ACC酶活性。將菌種接種到設(shè)置的不同條件的液體培養(yǎng)基中，在150 r/min下，培養(yǎng)24 h，分別測(cè)定IAA含量和ACC脫氨酶活性。其中，研究pH、溫度、轉(zhuǎn)速產(chǎn)IAA培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基，條件設(shè)置為：pH為4、5、6、7、8；溫度為20、25、30、35、40℃；轉(zhuǎn)速為 90、120、150、180、210 r/min。研究氮源、碳源產(chǎn)IAA培養(yǎng)基選用King’s培養(yǎng)基，條件設(shè)置為：碳源為甘油，葡萄糖，蔗糖，木糖，麥芽糖；氮源為硫酸銨，硝酸鉀，尿素，蛋白胨，酵母粉。轉(zhuǎn)速為90、120、150、180、210 r/min。ACC脫氨酶選用ADF培養(yǎng)基，條件設(shè)置為pH為4、5、6、7、8；溫度為20、25、30、35、40℃ ；ACC 底物濃度為 0.5、5、50、500 μL。

1.2.1 檢查前護(hù)理工作 護(hù)理人員需要為患者提供良好的護(hù)理環(huán)境，并且要確保檢查設(shè)備的完善程度，具體需要將患者檢查環(huán)境溫度控制在20～24℃，將濕度控制在50%～60%，并且要定期對(duì)檢查科室進(jìn)行清潔和消毒工作，以此來(lái)預(yù)防院內(nèi)感染現(xiàn)象。此外，護(hù)理人員需要結(jié)合患者的病情和心理承受能力，對(duì)患者進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌参亢烷_(kāi)導(dǎo)，并向患者講述基本的檢查流程，提高患者對(duì)胃鏡檢查工作的了解程度。

1.2.6 苜蓿促生菌盆栽實(shí)驗(yàn) 盆栽實(shí)驗(yàn)，每盆裝土1 kg。設(shè)置鈾濃度分別為 25、50、75、100 mg/kg。苜蓿種子經(jīng)表面滅菌，催芽后種植入含鈾土壤中，每盆種植10顆。接菌處理，將所篩菌株接種到King’s培養(yǎng)基中，以所得的最佳條件培養(yǎng)24 h。將所得培養(yǎng)液4℃，8 000 r/min離心，棄去上清液，用無(wú)菌水沖洗3次，調(diào)整OD600值為1，每盆均勻噴灑50 mL，每15天添加1次。以不加菌液為對(duì)照，噴灑等量的無(wú)菌水。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。60 d后收獲植物，將植物120℃殺青0.5 h，80℃烘至橫重。1.2.7 數(shù)據(jù)處理 參考蘇峰丙［15］的方法測(cè)定植株的鈾含量以及植株鈾積累量，植株鈾積累量=植株鈾含量×植株干重。利用 DPS 7.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；Origin Pro 8. 5 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 耐鈾內(nèi)生菌的分離篩選

經(jīng)過(guò)分離純化，從鈾尾礦區(qū)酸模根部分離出細(xì)菌32株，其中有11株在100 mg/L的鈾篩選平板上長(zhǎng)勢(shì)良好。分別為D1、D4、D5、D6、D11、D13、D15、D16、D18、D26、D29。

2.2 待測(cè)菌株促生潛力研究

如圖1所示，D5、D16和D26具有產(chǎn)IAA能力和ACC脫氨酶活性，D5菌株24 h產(chǎn)IAA含量為58.6 mg/L，ACC 脫氨酶活性為 0.14（U/μg）。D16 菌株24 h產(chǎn)IAA含量為40.21 mg/L，ACC脫氨酶活性為 0.32（U/μg）。D26菌株 24 h產(chǎn) IAA 含量為 18.3 mg/L，ACC脫氨酶活性為0.34（U/μg）。由于這3種菌株的IAA產(chǎn)量和ACC脫氨酶活性都相對(duì)較高，因此選用D5、D16、D26進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 內(nèi)生促生菌鈾及伴生重金屬抗性實(shí)驗(yàn)

如表2所示，D5菌株對(duì)鈾、錳、鉛、鎳4種重金屬的最小抑制濃度為300、1 200、1 000、75 mg/kg；D16菌株對(duì)鈾、錳、鉛、鎳4種重金屬的最小抑制濃度為350、1 200、800、125 mg/kg；D26菌株對(duì)鈾、錳、鉛、鎳4種重金屬的最小抑制濃度為300、1 400、1 200、100 mg/kg。D16對(duì)鈾、鎳有較強(qiáng)的耐受能力。D26對(duì)錳和鉛具有較強(qiáng)的耐受能力。

2.4 D16的生理生化及分子鑒定

圖1 耐鈾菌株的植物促生特性

表2 待測(cè)菌株的最小重金屬抑制濃度

因?yàn)镈16菌株具有較強(qiáng)的鈾耐受性（表2），且具有較好的植物促生性能（圖1）。因此，將其選為目標(biāo)菌株。依據(jù)細(xì)菌分類(lèi)手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行了生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)（表3），革蘭氏檢測(cè)結(jié)果為陰性。對(duì)D16的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR反應(yīng)得到1 649 bp 大小的擴(kuò)增片段，擴(kuò)增后的 DNA片段經(jīng)過(guò)純化測(cè)序，并在 Gen Bank 中與相似性較高的菌株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)D16與木糖氧化無(wú)色桿菌相似度最高，相似度為99%。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），證實(shí)該菌株與木糖氧化無(wú)色桿菌親緣關(guān)系最近。

2.5 D16促生特性研究

2.5.1 溫度對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)IAA的影響 由圖3-A所示，在20-35℃范圍內(nèi)，D16菌株的生長(zhǎng)量隨溫度升高而增加，在35℃時(shí)達(dá)到最大值，OD600值為2.54。35℃后，生長(zhǎng)量開(kāi)始降低，到40℃時(shí)OD600值為1.93。IAA的產(chǎn)量隨生長(zhǎng)量的改變而改變，因此，在20-35℃時(shí)，IAA產(chǎn)量逐步增加，在35℃時(shí)，達(dá)到最大值，最大IAA產(chǎn)量為42.12 mg/L。35℃后，IAA產(chǎn)量開(kāi)始降低，到40℃時(shí)，IAA產(chǎn)量為23.72 mg/L。

2.5.2 不同轉(zhuǎn)速基對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)IAA的影響 如圖3-B所示，轉(zhuǎn)速在90-180 r/min時(shí)，D16菌株的生長(zhǎng)量隨轉(zhuǎn)速提高而逐漸增加，OD600分別為2.69、2.72、2.75、2.78，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于180 r/min后，菌株生長(zhǎng)量開(kāi)始下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)OD600為2.55，由此可知，轉(zhuǎn)速對(duì)D16的生長(zhǎng)量影響較小。但在90-150 r/min范圍內(nèi)，IAA產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而快速增加，分別為28.94、31.55、38.98 mg/L，且在150 r/min，達(dá)到最大值。當(dāng)轉(zhuǎn)速大于150 r/min時(shí)，IAA產(chǎn)量先下降后上升，在180、210 r/min時(shí)分別為 37.16、40.91 mg/L。

表3 D16菌株的生理生化鑒定

圖2 基于16s rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.5.3 pH對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)IAA的影響 如圖3-C所示，pH 為 4 和 8 時(shí)，D16菌株生長(zhǎng)受到抑制，IAA產(chǎn)量下降。pH8時(shí)，菌株受到的抑制作用最大OD600值為2.02，IAA產(chǎn)量最少為17.82 mg/L。pH在 5-7時(shí)，菌株生長(zhǎng)量逐漸增加，且在pH6時(shí)達(dá)到最大值OD600為2.46。在pH為4-6這段范圍內(nèi)IAA 分泌量緩慢增加。當(dāng)pH在6-7時(shí)，IAA 的增長(zhǎng)速率隨著 pH 的增大迅速變大并于pH7時(shí)達(dá)到最大，最大產(chǎn)量為34.84 mg/L。

2.5.4 氮源對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)IAA的影響 從4-A可以看出，5種氮源對(duì)D16菌株生長(zhǎng)影響的順序?yàn)椋航湍父啵镜鞍纂耍灸蛩兀玖蛩徜@＞硝酸鉀，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600為2.41；對(duì)菌株分泌 IAA 的影響順序?yàn)椋航湍父啵镜鞍纂耍灸蛩兀玖蛩徜@＞硝酸鉀，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r(shí)，菌株產(chǎn)IAA的活性最強(qiáng)，IAA產(chǎn)量為37.82 mg/L。

2.5.5 碳源對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)IAA的影響 由圖4-B所示，5種碳源對(duì)D16菌株生長(zhǎng)影響的順序?yàn)椋焊视停菊崽牵酒咸烟牵菊崽牵灸咎牵钧溠刻?，?dāng)碳源為甘油時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600為0.97。對(duì)菌株分泌IAA的影響順序?yàn)椋焊视停菊崽牵酒咸烟牵灸咎牵钧溠刻恰．?dāng)甘油為碳源時(shí)，菌株產(chǎn)IAA的活性最強(qiáng)，IAA產(chǎn)量為10.76 mg/L。

2.5.6 底物濃度對(duì)D16菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的影響 如圖5所示，菌株D16的脫氨酶活性隨著底物濃度的增加而上升。在底物濃度為0時(shí)，脫氨酶活性幾乎檢測(cè)不到。

2.5.7 pH對(duì)D16菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的影響 如圖6-A所示，當(dāng)培養(yǎng)基pH小于5時(shí)，D16菌株無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶；當(dāng)pH大于7時(shí)，酶活開(kāi)始受到抑制；pH7時(shí)，酶活最大為0.312 6 U/μg。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

2.5.8 溫度對(duì)D16菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的影響 如圖6-B，當(dāng)溫度在20-30℃時(shí)，D16菌株ACC脫氨酶活性隨溫度升高而升高。在30℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值為0.317 9 U/μg。當(dāng)溫度高于30℃，酶活顯著下降，在40℃時(shí)，檢測(cè)不到酶活。

圖4 不同氮源、碳源對(duì)D16菌株的生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

圖5 底物濃度對(duì)D16菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的影響

2.5.9 轉(zhuǎn)速對(duì)D16菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的影響 如圖6-C，轉(zhuǎn)速對(duì)D16脫氨酶的活性影響不大。當(dāng)轉(zhuǎn)速在90-180 r/min時(shí)，D16菌株的ACC脫氨酶活性隨轉(zhuǎn)速提高而緩慢增加，分別為0.311 0、0.325 1、0.325 2、0.343 8 U/μg，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于180 r/min后，酶活開(kāi)始緩慢下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)，酶活為0.3148 U/μg。2.5.10 D16菌株對(duì)苜蓿生長(zhǎng)與鈾積累的影響研究 由圖7可知，在接種D16菌株后，能提高苜蓿的生物量。其中，在沒(méi)有鈾脅迫的情況下，能提高干重160%；在25 mg/kg的鈾脅迫下，能提高67.5%的干重；在50 mg/kg的鈾脅迫下，能提高29.5%的干重；在75 mg/kg的鈾脅迫下，能提高17.9%的干重；在100 mg/kg的鈾脅迫下，能提高110.4%的干重。

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)D16菌株的ACC脫氫酶的影響

由圖8可知，接種菌株D16后，苜蓿中鈾的含量和積累量也有所提高。在25 mg/kg的鈾脅迫下，能提高12.2%的鈾植株含量，鈾的積累量卻沒(méi)有提高；在50 mg/kg的鈾脅迫下，能提高45.5%的鈾植株含量和11.8%的鈾植株積累量；在75 mg/kg的鈾脅迫下，能提高36.3%的鈾植株含量和88.8%的鈾植株積累量；在100 mg/kg的鈾脅迫下，能提高180.6%的鈾植株含量和78.6%的鈾植株積累量。

3 討論

圖7 不同鈾濃度處理下D16對(duì)苜蓿生物量的影響

圖8 不同鈾濃度處理下D16對(duì)苜蓿富集鈾的影響

在植物修復(fù)放射性和重金屬污染中，植物促生菌的加入是一個(gè)較佳的方法，它能促進(jìn)植物生長(zhǎng)同時(shí)減輕放射性核素及重金屬對(duì)植物的脅迫作用［16］。Ying等［17］從銅礦區(qū)土壤篩選的一株氧化木糖無(wú)色桿菌對(duì)銅的最小抑制濃度能達(dá)到600 mg/L，重金屬污染地區(qū)的植物內(nèi)生菌通常表現(xiàn)出較高的重金屬耐受能力［18］。本研究從某典型鈾尾礦區(qū)的蓼科植物酸模根部分離篩選出耐受一定濃度鈾的菌株D16，對(duì)鈾的最小抑制濃度能達(dá)到350 mg/kg，經(jīng)鑒定為氧化木糖無(wú)色桿菌種。這說(shuō)明該種菌株具有較強(qiáng)的重金屬耐受力。

植物促生菌所分泌的IAA是一種重要的植物激素，參與整個(gè)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物根系對(duì)礦質(zhì)元素的吸收［19］。潘風(fēng)山［20］從鎘超積累植物東南景天根部分離出一株產(chǎn)IAA的細(xì)菌，可使油菜地上部分的生物量提高 18.6%，同時(shí)對(duì)鎘的積累量提高45%。在重金屬、干旱等逆境條件下，乙烯會(huì)在植物體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生，抑制植物根系的生長(zhǎng)，阻礙植物體正常的生長(zhǎng)發(fā)育［21］。植物促生菌產(chǎn)生的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶能將ACC 分解成 α-丁酮酸（α-ketobutyrate）和氨，這種物質(zhì)是合成乙烯的前體物質(zhì)。從而降低植物體內(nèi)乙烯的水平，同時(shí)氨能作為植物所需氮源被利用，從而緩重金屬給植物生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)的不良?jí)毫Γ岣咧参飳?duì)重金屬離子的吸收［22］。吉云秀［23］從被石油污染的鹽漬地區(qū)的植物翅堿蓬的根際土中分離出4種含有ACC脫氨酶的植物促生菌，且均能提高燕麥或者黑麥草的耐鹽性和生長(zhǎng)參數(shù)?，F(xiàn)有的研究表明，如果菌株具有一種促生性能，便具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力［24］。本研究所篩菌株D16所表現(xiàn)的植物促生特征包括產(chǎn)生IAA和具有ACC脫氨酶，可能有更好的促生效果。

在誘導(dǎo)IAA培養(yǎng)基中，當(dāng)pH為7時(shí)，菌株D16的IAA產(chǎn)量最大，這與徐文思［25］等篩選的菌株的產(chǎn)IAA的最適 pH 為8的結(jié)果不同，其原因應(yīng)該是由于篩選出的菌株種屬不同。D16菌株隨轉(zhuǎn)速增加生長(zhǎng)量緩慢增加，而IAA產(chǎn)量迅速增加，可能是由于菌株的生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)生均是好氧過(guò)程，菌株優(yōu)先保證生長(zhǎng)繁殖，再產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。當(dāng)以酵母膏和蛋白胨為氮源時(shí)，菌株D16的生長(zhǎng)量和IAA的產(chǎn)量都為最高，說(shuō)明有機(jī)氮源對(duì)菌株D16優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。

當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)ACC時(shí)，菌株檢測(cè)不到ACC脫氨酶活性，而隨著ACC濃度升高，酶活性增強(qiáng)，這與蒙淵［26］的結(jié)果相一致，這說(shuō)明ACC脫氨酶為誘導(dǎo)酶。菌株D16所產(chǎn)ACC脫氨酶活性在pH為7時(shí)，有較高酶活，而當(dāng)pH小于7時(shí)酶活迅速下降，pH大于7時(shí)酶活降低緩慢，這與沈萍［27］的結(jié)果相似，說(shuō)明ACC脫氨酶不耐酸，而對(duì)偏堿性條件有一定的適應(yīng)力。

將植物內(nèi)生菌用于提高植物修復(fù)土壤重金屬效率已有較多研究，從商陸中篩選出的一種芽孢桿菌SLS18，不僅能促進(jìn)甜高粱生長(zhǎng)，還能提高對(duì) Mn /Cd的吸收［28］。Zhang等［29］研究發(fā)現(xiàn)一株鞘氨醇單胞菌不僅可以增加?xùn)|南景天生長(zhǎng)，同時(shí)能提升東南景天對(duì) Cd 的吸收。促生菌促進(jìn)植物修復(fù)鈾污染的研究相對(duì)較少，Muhammad［30］的研究表明，利用從牧豆樹(shù)枝分離的3種促生菌可以促進(jìn)雙稃草的生長(zhǎng)和對(duì)鈾和鎘的積累。紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生的豆科草本植物，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力。Peralta-Videa等［31］的研究表明，紫花苜蓿對(duì)土壤中的Cd、Cu 或 Zn 具有較強(qiáng)的富集能力，是一種很有開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值的土壤修復(fù)植物。唐永金［32］和金星等［33］研究表明，紫花苜蓿能夠很好的吸收和富集土壤中的鈾。本研究從鈾尾礦區(qū)植物酸模根部分離出一株耐鈾內(nèi)生菌，結(jié)果表明該菌株可以促進(jìn)苜蓿生長(zhǎng)，同時(shí)還能提高苜蓿對(duì)鈾的積累能力，這對(duì)于植物修復(fù)鈾尾礦區(qū)的污染土壤具有十分重要的作用和意義。

4 結(jié)論

從某典型鈾尾礦區(qū)植物酸模根部分離到的一株耐鈾菌株具有較強(qiáng)的IAA產(chǎn)率和ACC脫氨酶活性，經(jīng)過(guò)生理生化及分子鑒定表明該菌株屬于無(wú)色木糖氧化桿菌。該菌株最佳產(chǎn)IAA條件為35℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為150 r/min，氮源為酵母膏，碳源為甘油；最佳ACC酶活條件為溫度為30℃，pH為7，轉(zhuǎn)速180 r/min。該菌株植物促生特性能使苜蓿干重分別提高17.9%-110.4%；植株對(duì)鈾的富集率分別提高12.2%-180.6%。