吳利 陳少金 李周揚(yáng) 陳謙 黎元莉

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase，MTRR）是葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位點(diǎn)多態(tài)性可使其相應(yīng)酶活性降低，在同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼岬倪^程中出現(xiàn)障礙，造成葉酸水平降低及血漿中同型半胱氨酸濃度升高［1-2］。而同型半胱氨酸水平的升高可使新生兒神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、先心病及孕產(chǎn)婦妊娠高血壓、貧血、自發(fā)性流產(chǎn)等疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加［3-4］。MTHFR與MTRR基因多態(tài)性存在地區(qū)及民族的分布差異，目前尚未見三亞地區(qū)關(guān)于葉酸利用能力的大樣本研究報(bào)道。本文對(duì)三亞市漢族和黎族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性進(jìn)行分析，并與國(guó)內(nèi)其他民族進(jìn)行對(duì)比，旨在闡明本地區(qū)人群的遺傳特征，為出生病因?qū)W研究及基于遺傳特征的個(gè)體化治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)知情同意原則，選擇2014年10月至2018年7月在三亞市人民醫(yī)院進(jìn)行孕前或孕期檢查的漢族女性1 590例，年齡（27.55±4.79）歲；黎族女性420例，年齡（26.65±4.67）歲。排除非本地區(qū)戶籍以及DNA抽提不符合要求的人群，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器及試劑

MTHFR C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR A66G位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）分型采用Taqman-MGB技術(shù)測(cè)定。儀器：低溫離心機(jī)Beckman J-6BABI、ABI 7900型熒光定量PCR儀；試劑：Buffer A、Buffer B、飽和酚、氯化鈉及異丙醇等。相關(guān)儀器、試劑均使用美國(guó)Applied Biosystems（AB）公司產(chǎn)品。

1.3 基因分型

采集口腔黏膜上皮細(xì)胞，采用硅膠吸附法提取基因組DNA。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位點(diǎn)SNP。PCR 反應(yīng)體系為 10 μL，包含 1 μL 基因組DNA（20 ng/μL），5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB 探針（表1），3.5 μL 去離子水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；92℃變性15 s，60℃延伸 1 min，20個(gè)循環(huán)；89℃變性 15 s，60℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，在ABI 7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。

表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢肨able 1 Taqman-MGB probe location

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Haplo-View 4.2進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡、LD水平及單倍型結(jié)構(gòu)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，對(duì)基因型及等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

對(duì)三亞市1 590例漢族和420例黎族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。其中，漢族女性MTHFR C677T位點(diǎn)不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=14.83，P＜0.05），不具有本地區(qū)代表性，后文不予分析；黎族女性的MTHFR C677T位點(diǎn)及漢族和黎族女性的MTHFR A1298C與MTRRA66G位點(diǎn)檢驗(yàn)結(jié)果符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），具三亞地區(qū)群體代表性。

2.2 三亞黎族女性與不同民族女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率分布比較

三亞黎族女性MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與思南苗族［5］、延邊朝鮮族［6］、南寧壯族［7］、烏蘇哈薩克族［8］、銀川回族［9］、新疆維吾爾族［10］、張家界土家族［11］相比均有顯著性差異（P＜0.05）。三亞黎族女性MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與南寧壯族［7］、烏蘇哈薩克族［8］、新疆維吾爾族［10］相比無顯著性差異（P＞0.05），與文中其他民族相比有顯著性差異（P＜0.05）。三亞黎族女性MTRR A66G位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與烏蘇哈薩克族［8］和新疆維吾爾族［10］相比無顯著差異（P＞0.05），與文中其他民族相比有顯著性差異（P＜0.05）（表2、3）。

2.3 MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)連鎖情況及單倍型分析

三亞市黎族女性MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)組合情況見表4。單倍型結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示存在3種組合AC（56.1%）、CC（30.6%）、AT（13.3%）。兩位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象（D'=1.00，r2=0.07）。

表2 三亞黎族與不同民族女性MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)與頻率［n（%）］Table 2 Comparison of MTHFR and MTRR genotype distribution and frequencies between the Li women in Sanya and other different nations［n（%）］

表3 三亞黎族與不同民族女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)與頻率［n（%）］Table 3 Comparison of MTHFR and MTRR allele frequencies between the Li women in Sanya and other different nations［n（%）］

表4 MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布［n（%）］Table 4 Distribution of linkage between MTHFR C677T and A1298C［n（%）］

3 討論

葉酸是一種水溶性維生素，在生物體內(nèi)以四氫葉酸的形式發(fā)揮作用，四氫葉酸是細(xì)胞生化反應(yīng)中甲基的主要供應(yīng)者，參與嘌呤及嘧啶的合成及同型半胱氨酸的代謝［12］。葉酸缺乏可引起5-甲基四氫葉酸水平下降，從而使S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）水平下降，最終導(dǎo)致DNA低甲基化。此外，低葉酸水平還可使尿嘧啶錯(cuò)誤摻入DNA，使DNA鏈斷裂增加，并可導(dǎo)致DNA在復(fù)制過程中錯(cuò)誤發(fā)生率增加，影響DNA的生物合成。體內(nèi)葉酸水平由葉酸攝入量和葉酸代謝水平?jīng)Q定，正常的葉酸水平對(duì)于正常胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育是必不可少的［13］?，F(xiàn)已有研究表明，葉酸代謝障礙與唇腭裂、先天愚型、心臟畸形、多發(fā)畸形、泌尿系統(tǒng)畸形、肢體畸形、妊娠期貧血、妊娠期高血壓的發(fā)生具有相關(guān)性［14］。葉酸缺乏在我國(guó)漢族女性中的發(fā)生率極高，遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家。

葉酸代謝過程是一個(gè)涉及包括5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、甲硫氨酸合成酶（MTR）、甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）和胱硫醚-β-合酶（CBS）等多種酶參與的過程，其中MTHFR和MTRR是葉酸代謝過程中發(fā)揮重要作用且突變率較高的關(guān)鍵酶［13］。在葉酸代謝過程中，MTHFR是葉酸活化的核心酶，也是同型半胱氨酸代謝和甲硫氨酸合成的關(guān)鍵酶，其不可逆地催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸。而MTRR是參與同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶，其通過催化還原維生素B12（甲基鈷胺素）甲基化狀態(tài)而維持MTR的活性，是平衡同型半胱氨酸水平的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究已證實(shí)，MTHFR和MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性均可引起酶活性降低，從而影響葉酸代謝，造成同型半胱氨酸的堆積，增加出生缺陷發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［15］。本研究針對(duì)三亞市黎族和漢族女性中MTHFR最常見的突變位點(diǎn)MTHFR C677T和A1298C，以及MTRR最常見的突變位點(diǎn)MTRR A66G這3個(gè)基因位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)分析，以闡明本地區(qū)不同民族人群的遺傳特征，了解其與國(guó)內(nèi)其他民族基因多態(tài)性分布的差異，為下一步有針對(duì)性的進(jìn)行出生缺陷干預(yù)奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，三亞黎族女性的MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與思南苗族［5］、延邊朝鮮族［6］、南寧壯族［7］、烏蘇哈薩克族［8］、銀川回族［9］、新疆維吾爾族［10］、張家界土家族［11］相比均有顯著性差異（P＜0.05），表明該位點(diǎn)的多態(tài)性分布存在民族差異。除去烏蘇哈薩克族和新疆維吾爾族，本文列舉的其他少數(shù)民族符合從北到南T等位基因頻率逐漸遞減的趨勢(shì)（最高為銀川51.80%，最低為三亞13.33%），與漢族的地域分布規(guī)律相似［16］，該位點(diǎn)的多態(tài)性分布存在地域差異。三亞市黎族與漢族女性的MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)多態(tài)性存在顯著性差異（P＜0.05），說明這2個(gè)位點(diǎn)在相同地區(qū)的不同民族間存在差異，該差異與地域分布無關(guān)。三亞黎族女性MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率除與南寧壯族［7］、烏蘇哈薩克族［8］、新疆維吾爾族［10］相比無顯著性差異（P＞0.05），與文中列舉的其他民族相比均有顯著性差異（P＜0.05）。除去烏蘇哈薩克族和新疆維吾爾族，本文列舉的其他少數(shù)民族符合從北到南C等位基因頻率逐漸遞增的趨勢(shì)（最高為三亞30.60%，最低為延邊18.20%），該位點(diǎn)的多態(tài)性分布存在一定的地域差異，但差異性沒有MTHFR C677T位點(diǎn)的強(qiáng)。三亞黎族女性MTRR A66G位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率除與烏蘇哈薩克族［8］和新疆維吾爾族［10］相比無顯著差異（P＞0.05），與文中列舉其他民族相比均有顯著性差異（P＜0.05）。表明MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)的多態(tài)性分布存在民族差異，但其民族特異性可能沒有MTHFR C677T位點(diǎn)強(qiáng)。MTHFR C677T和MTHFR A1298C位點(diǎn)多態(tài)性的分布存在地域差異，MTRR A66G位點(diǎn)的多態(tài)性分布未發(fā)現(xiàn)有地域差異。

我國(guó)漢族人群MTHFR C677T位點(diǎn)的多態(tài)性具有地域性差異，T等位基因頻率呈現(xiàn)北高南低的趨勢(shì)，MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)多態(tài)性的地域差異相對(duì)來說比較不明顯［16］。而三亞市漢族人口來源駁雜，祖籍本地的漢族居民所占比例較少，這可能是造成MTHFR C677T位點(diǎn)不符合Hardy-Weinberg平衡的原因。

本研究對(duì)三亞黎族女性的MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)均進(jìn)行了單倍型連鎖不平衡研究。MTHFR C677T位點(diǎn)位于第一號(hào)染色體MTHFR基因第5個(gè)外顯子上，物理位置為11796321 bp。MTHFR A1298C位點(diǎn)位于第一號(hào)染色體MTHFR基因第8個(gè)外顯子上，物理位置為11794419 bp。理論上，連鎖不平衡性隨著遺傳距離的增加而下降，通過分析，D'=1.00，表明兩位點(diǎn)間存在連鎖關(guān)系，r2=0.07，表明兩位點(diǎn)間的連鎖強(qiáng)度不高。三亞黎族女性的MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)間存在連鎖平衡，但連鎖強(qiáng)度不高，可能發(fā)生了基因重組等情況。

目前孕期保健措施為育齡婦女從孕前3個(gè)月至妊娠滿3個(gè)月每日補(bǔ)服葉酸，根據(jù)不同的生育史、家族史等情況服用不同劑量［17］。而葉酸代謝障礙的人群，對(duì)葉酸的利用率較低。通過遺傳篩查，可針對(duì)存在葉酸代謝障礙的人群采取增加營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)等等干預(yù)措施，達(dá)到出生缺陷一級(jí)預(yù)防的目的，以達(dá)到預(yù)防出生缺陷兒出生和提高人口素質(zhì)的目的。