洪 辰，胡文君，王淑娜，李志勇，繆朝玉

(海軍軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海 200433)

認知是機體認識和獲取知識的智能加工過程，涉及學習、記憶、語言、思維、精神、情感等行為。認知障礙指與上述學習記憶以及思維判斷有關的大腦高級智能加工過程出現異常，從而引起學習、記憶功能障礙，任何引起大腦功能和結構異常的因素均可能導致認知障礙。隨著人類壽命的延長，認知功能下降逐漸成為老齡化人群最嚴重的健康威脅之一，也給社會及家庭帶來了沉重的經濟負擔和精神壓力[1]。根據文獻報道，2010年我國癡呆的患病人數為919萬人，患病率約為9.87‰，其中阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)患者569萬人，患病率為6.25 ‰[2]。但是到目前為止，研究者們對于這些伴有認知障礙的疾病，如AD、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington′s disease, HD)、血管性癡呆(vascular dementia, VD)以及帕金森病(Parkinson′s disease, PD)等的病因和發(fā)病機制仍不十分清楚，對于有效治療和緩解認知障礙的藥物也需要進行深入研究。所以，建立有效的整體動物和細胞水平的模型對于疾病研究和藥物研發(fā)都有十分重要的意義。

D-半乳糖[D-(+)galactose, D-gal](圖 1)致認知障礙模型主要原理是過量的D-gal代謝產物在細胞內蓄積，使細胞產生活性氧，對生物體造成氧化應激損傷，而該損傷則模擬動物的老化過程，造成生物體認知功能下降。海馬區(qū)是與學習記憶功能聯系最為緊密的區(qū)域之一，并且是成年個體大腦中少數可以產生新生神經元的區(qū)域[3-4]，所以，直接在海馬區(qū)神經元細胞層面進行干預可以得到與認知功能相關的更有意義和說服力的結論。根據目前的文獻報道，鮮有將D-gal整體及離體模型聯合應用于發(fā)病機制及藥效學評價過程，特別是針對海馬區(qū)神經元的D-gal離體模型較少受到關注。所以，確立這兩種模型穩(wěn)定的建立方法并對其功能進行評估，確定其聯合應用的可行性，將會在新藥研發(fā)以及闡明認知功能下降機制等研究領域發(fā)揮一定的積極作用。同時，對于用于檢測嚙齒類動物的學習和記憶功能的經典Morris水迷宮實驗，目前僅有實驗方法的報道，鮮有文獻介紹該動物行為學實驗的細節(jié)和經驗，本實驗室根據目前已報道的實驗方法進行了多次實驗，也總結得出一些實踐經驗。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

D-gal購自生工生物工程(上海)股份有限公司(產品編號：A600215-0025)；分子指標檢測試劑盒包括Caspase-3、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、CCK8，均購自碧云天生物技術有限公司(產品編號：C1116、S0131、S0101、S0056、C0037)；Neurobasal A 培養(yǎng)基、B27+Vitamin A supplement及GlutaMAX均購自Invitrogen公司(貨號：10888022、17504044、35050-061)；Accutase酶及青霉素-鏈霉素購自Gibco公司(貨號：A11105-01、15140122)；高糖DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司(貨號：SH30243.01)。

1.2 儀器與設備

Morris水迷宮實驗采集分析系統(tǒng)(型號：XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司)；M200 PRO多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；高速冷凍離心機(型號：Neofuge13R，上海力申科學儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級7周齡C57BL/6J小鼠及生后1 d幼鼠(海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心)。實驗動物飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)動物房，自由飲水、進食，溫度(23±2) ℃，相對濕度40%～60%，噪聲≤60 dB，采用人工照明，晝夜均為12 h；生后第1 天的幼鼠當天進行實驗。實驗方案遵守動物福利、動物倫理及動物保護等相關規(guī)定。

2 方法

2.1 分組與處理

C57BL/6J小鼠Morris水迷宮實驗：7周齡實驗動物在動物房適應環(huán)境1周后，根據性別分組，進行Morris水迷宮實驗。C57BL/6J小鼠制備D-gal模型：7周齡雌性小鼠在動物房適應環(huán)境1周后，隨機分為模型組和對照組，模型組連續(xù)腹腔注射D-gal生理鹽水溶液8周，劑量為100 mg/kg；溶劑對照組連續(xù)腹腔注射10 ml/kg體積的生理鹽水溶液8周[5]。C57BL/6J小鼠海馬區(qū)神經元細胞制備體外D-gal模型：將體外培養(yǎng)生長第8天的海馬區(qū)神經元細胞隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予不同濃度的D-gal，對照組則采用無藥物培養(yǎng)基，兩組均處理48 h。

2.2 Morris水迷宮實驗

基于Vorhees的實驗方法[6]，課題組對某些細節(jié)做出修改，簡述如下：在黑色水盆(直徑120 cm、高35 cm)內注水，維持水溫在(22±1) ℃；將水染成白色并人為劃分成4個象限，在其中一個象限中固定一個直徑為10 cm的透明平臺，平臺高度保持在水平面以下1 cm；水池用簾布遮擋，懸掛方向標志物。實驗連續(xù)進行，共計6 d，1～5 d是空間采集實驗，第6天是探測實驗。在1～5 d，動物從盆壁4個固定位置面對盆壁入水，如果60 s內未找到隱藏在水下的平臺，則引導動物到平臺并停留20 s；第6天，撤去平臺，動物從平臺所在象限的對側盆壁最遠處入水。由視頻跟蹤監(jiān)測系統(tǒng)自動記錄相關信息后對參數進行分析。

2.3 小鼠海馬區(qū)原代神經元培養(yǎng)

將C57BL/6J出生第1天的幼鼠(P0～P1)預先在冰冷的75 %乙醇中處死，隨后斷頭取腦，在顯微鏡下于冰冷的高糖DMEM培養(yǎng)液中分離海馬區(qū)，去掉軟腦膜，之后將海馬組織剪碎，用Accutase酶消化，置于37 ℃搖床中消化10 min后，加入FBS(終濃度為10%即可)終止消化。隨后在離心機中以1 000 r/min離心5 min，用接種培養(yǎng)基(含20 %FBS的高糖DMEM溶液)重懸后通過40 μm尼龍濾器去除組織碎片，以獲得單個細胞，再用接種培養(yǎng)基重懸細胞，最后以250 μl/孔的細胞懸浮液接種在48孔板中或者以2 000 μl/孔的細胞懸浮液接種在6孔板中[活細胞密度為4×105個/ml，孔板預先用聚-D-賴氨酸(PDL)包被過夜]，并在接種4～6 h后更換成生長培養(yǎng)基(Neurobasal A 培養(yǎng)基中添加50×B27+Vitamin A 細胞培養(yǎng)添加劑，0.5 %谷氨酰胺添加劑和1 %的青霉素-鏈霉素)。接種后隔天換液，并在接種后第3天加入阿糖胞苷(終濃度為2.5 μg/ml)處理48 h抑制膠質細胞生長，接種后第7天進行海馬神經元純度鑒別(神經元特異性標記物Tuj-1)，保證神經元比例≥90%，在接種后第8天進行干預[7]。

2.4 分子生物學指標的檢測

Caspase3、 丙二醛(MDA)、 總超氧化物歧化酶 (SOD)、 谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-px)的檢測嚴格按照試劑盒提供的方法和步驟進行； CCK8則按照1∶10的比例將試劑加入細胞培養(yǎng)基中， 37 ℃孵育1 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

2.5 統(tǒng)計學分析

實驗數據除Morris水迷宮空間采集實驗采用(均值±標準誤)之外，其余均采用(均值±標準差)；兩組之間比較時，計量資料數據采用t檢驗，計數資料采用Mann-Whitney U秩和檢驗，多組計數資料則采用One-way ANOVA并Dunnett-t檢驗；以P<0.05時為兩組差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 C57BL/6J小鼠Morris水迷宮實驗

從1～5 d的空間采集實驗結果可見(圖2A)，自第2天起，雄性小鼠到達平臺的潛伏期始終短于雌性小鼠，但是兩組小鼠到達平臺期的時間并無統(tǒng)計學差異；在第6天的探測實驗中可以發(fā)現，雄性小鼠穿越平臺的次數以及在平臺所在象限停留的時間均高于雌性小鼠(圖2B、圖2C)，但差異無統(tǒng)計學意義。從實驗結果可以看出，按照規(guī)定的實驗方法能夠觀察到生理狀態(tài)下C57BL/6J小鼠的學習曲線，兩種性別小鼠的學習和記憶能力接近。

3.2 C57BL/6J小鼠制備D-gal模型Morris水迷宮實驗

從1～5 d的空間采集實驗結果可見，在第4天和第5天兩組小鼠到達平臺的潛伏期存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，給予D-gal的模型組小鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組(圖3 A)，說明模型組小鼠的學習能力較差；在第6天的探測實驗中可以發(fā)現，模型組小鼠在平臺所在象限停留的時間明顯短于對照組(P<0.05，圖3B)，但兩組在穿越平臺次數指標中未見明顯的統(tǒng)計學差異(圖3 C)，說明模型組動物的記憶功能也較差。

3.3 C57BL/6J小鼠制備D-gal模型相關分子生物學指標檢測

在腦組織蛋白水平上的檢測結果顯示，模型組小鼠腦組織中的凋亡通路Caspase-3酶的含量(P<0.001，圖4A)、MDA的含量(P<0.05，圖4B)以及GSH-px的含量(P<0.05，圖4C)均明顯高于對照組，說明D-gal促進模型組小鼠神經元的凋亡、造成模型組腦組織脂質過氧化損傷，但兩組小鼠腦組織中SOD的含量(圖4 D)并無明顯差異。上述實驗結果證明，采用D-gal制備小鼠老化致癡呆模型成功，D-gal可以損害動物的學習和記憶功能。

圖3 D-gal模型小鼠的學習記憶功能A.1～5 d到達平臺的潛伏期；B.第6天穿越平臺所在象限時間；C.第6天穿越平臺次數*P<0.05，與對照組比較

圖4 D-gal模型小鼠腦組織的細胞凋亡水平和氧化應激損傷A.Casepase-3含量；B. MDA含量；C.GSH-px含量；D.SOD含量*P<0.05，***P<0.001，與對照組比較

3.4 C57BL/6J小鼠海馬區(qū)原代神經元制備D-gal模型分子生物學指標檢測

實驗結果表明，經D-gal處理后的小鼠海馬神經元，在藥物作用48 h以后(圖5)不同劑量的給藥組與對照組相比較，從3 mg/ml濃度開始，各組細胞活力均出現顯著性差異(P<0.05或P<0.001)，與此同時，在30 mg/ml的劑量時可以出現肉眼可見的神經元形態(tài)改變，包括神經元數量以及神經突觸減少，而在100 mg/ml的劑量時神經元只殘存胞體，幾乎看不到神經突觸的存在，可出現明顯的細胞毒性作用(圖6)。在神經元細胞氧化應激分子指標上的實驗結果顯示，與對照組相比,各濃度梯度的D-gal刺激均可以產生對神經元的損傷作用。其中, GSH-px各劑量組和對照組相比均有明顯差異(P<0.01或P<0.001，圖7 A)，但是SOD的含量與對照組相比，沒有統(tǒng)計學差異(圖7 B)，與之前在整體模型中得出的結論一致。上述實驗結果證明，采用D-gal制備的小鼠離體神經元損傷模型成功，D-gal可以對神經元造成細胞毒性以及氧化應激損傷。

圖5 不同D-gal濃度孵育48 h后對小鼠海馬神經元的細胞毒性損傷作用*P<0.05，***P<0.001，與0 mg/ml組比較

4 討論

隨著社會人口老齡化的加快，越來越多的老年人出現認知功能下降，給家庭和社會帶來了沉重的經濟和精神負擔。到目前為止，由衰老及其他疾病引發(fā)的認知功能下降的機制仍有待闡明[1]，同時，尚無一個公認有效的可以改善認知功能的藥物問世[8]。所以，建立有效的可以進行機制研究和新藥研發(fā)的整體及離體模型顯得尤為重要。D-gal模型是老年型癡呆的藥效學研究模型，屬于老化致癡呆模型的一個亞型。該模型的優(yōu)勢在于可以模擬正常個體衰老過程出現的認知障礙，方法簡便易行，模型周期相對較短，并可適用于Morris水迷宮、Y迷宮、曠野實驗、回避實驗、高架十字迷宮等多種動物行為學實驗[9]，但是，氧化應激致衰老并非認知功能下降的唯一原因，所以該模型的使用也存在一定程度的局限。D-gal離體神經元模型可以彌補D-gal整體動物模型在機制研究和藥物評價上的不足，其模型方法簡單，相比整體動物模型而言，離體模型直接作用于海馬區(qū)神經元細胞，且造模時間短，更適用于機制、分子水平和調控通路的研究。

圖6 不同D-gal濃度孵育48 h后對小鼠海馬神經元細胞形態(tài)的影響

而聯合應用整體及離體模型的方法，可以互相取長補短，除了可以驗證不同的動物表型，還可以進行藥效學實驗。但由于D-gal本身具有一定的毒性作用，根據文獻報道[10]和實驗結果，本實驗室認為在D-gal整體動物模型中以100 mg/kg為推薦劑量，造模時間為8周，在這個劑量及時間下既可以出現明顯的損傷效應，又不會導致不同組之間的實驗動物出現明顯的認知功能下降從而引起表型差異不明顯的情況發(fā)生；而D-gal離體細胞模型中以10 mg/ml為推薦劑量，48 h為推薦的造模時間，在此劑量及時間下，細胞可以出現氧化應激損傷但是沒有明顯的形態(tài)學改變，不影響后續(xù)結果的檢測。

根據目前的文獻報道，鮮有將D-gal整體及離體模型聯合應用于發(fā)病機制及藥效學評價過程，所以本研究方法將兩者結合應用可能會在新藥研發(fā)以及闡明認知功能下降機制等研究領域發(fā)揮一定的積極作用。

經過多次Morris水迷宮實驗發(fā)現，在前2天的訓練過程中，可適當延長動物在平臺上的停留時間至20 s，以便給動物更多的時間對周圍環(huán)境和空間線索進行學習記憶。與此同時，在實驗過程中需要密切監(jiān)視每只受試動物的行為表現，由于每只動物每天共進行4次實驗，對于明顯不符合其他3次實驗結果的數據可以考慮進行重新檢測。對于在不同訓練日出現波動甚至相反實驗結果的實驗個體可以考慮剔除或者增加訓練次數。對于個別始終找不到平臺的動物，除了考慮其認知功能確實下降之外，還應綜合考慮水溫、環(huán)境等外界因素對動物行為本身的干擾，特別是水溫對于受試動物的行為影響較大。由于動物行為學實驗數據存在的波動性較大，針對D-gal模型，根據薈萃分析的報道[11]，有1%的文獻采用不同動物行為學方法聯合檢測，包括Y迷宮、穿梭箱等，雖然所占比例較低，但是不失為一個優(yōu)選策略。聯合應用動物行為學方法可以考察不同方面的認知功能以互補長短，使結果更具有說服力。