彭章普， 王 潔， 麻和平， 張文齊， 劉彩云， 邵建寧*

（1.甘肅省科學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州 730000）

隨著我國蔬菜種植面積不斷擴大和蔬菜種植布局不斷集中，在蔬菜采收、初加工等過程中伴有大量尾菜產(chǎn)生。由于蔬菜產(chǎn)品具有較強的季節(jié)性，收獲和上市期短而集中，大量尾菜不僅未被合理利用，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，對尾菜進行處理利用，將尾菜變廢為寶，防止尾菜造成環(huán)境污染，對蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和環(huán)境保護具有重要意義（杜鵬祥等，2015；韓雪等，2015）。尾菜具有有機物和水分含量高，易腐爛變質(zhì)不宜貯存的特點，為解決尾菜污染環(huán)境，實現(xiàn)尾菜資源化利用，對經(jīng)過分撿后無腐爛變質(zhì)的尾菜進行青貯飼料制備，可以降低尾菜的營養(yǎng)物質(zhì)損失，較長期保持尾菜的青鮮狀態(tài)（任海偉等，2015；周苗苗等，2014；楊道蘭等，2014；馮煒弘等，2013）。尾菜青貯過程中乳酸菌必須具備較強的產(chǎn)酸能力并且活菌數(shù)達到一定數(shù)量，才能更好地發(fā)揮其生物功效，因此，使用產(chǎn)酸能力強、青貯發(fā)酵效果好的乳酸菌，是制備優(yōu)良青貯尾菜的關(guān)鍵（韓雪等，2013； 楊茁萌等，2012；Avila 等，2010； 潘艷等，2010）。目前專門針對尾菜青貯的青貯菌劑研究不多，自然青貯不能保證尾菜青貯的品質(zhì)，因此，研發(fā)適合尾菜青貯的青貯劑非常必要。泡菜中含有豐富的乳酸菌，從泡菜中分離篩選出適合尾菜青貯用的優(yōu)良乳酸菌是一條高效、快捷的途徑。本研究是從市售泡菜中分離出乳酸菌，進行產(chǎn)酸性能、青貯效果研究，篩選出適合尾菜青貯的乳酸菌菌株，對篩選出的乳酸菌利用5 L立瓶進行青貯菌劑制備工藝研究，確定篩選菌株培養(yǎng)最適收獲期和菌株配比，并對制備的尾菜青貯菌劑進行應(yīng)用試驗，為尾菜青貯菌劑的工業(yè)化開發(fā)提供菌種保證和科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 試驗菌株是從蘭州市售泡菜中分離篩選出的乳酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基按照《中國農(nóng)業(yè)菌種目錄》中的配方配制（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存管理中心，2012）；MC培養(yǎng)基按照《乳品微生物學(xué)實驗技術(shù)》中的配方配制（杜鵬，2006）。

1.1.3 青貯原料 挑選無腐爛變質(zhì)廢棄的白菜葉、青筍葉進行清洗，切割成長2～3 cm，寬1～2 cm，通過晾曬將廢棄白菜葉、青筍葉水分含量降至70%左右。

1.2 儀器與設(shè)備 JA2003N電子天平，上海精密儀器有限公司；DELTA 320 pH計，梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）；高壓蒸汽消毒器，上海醫(yī)用核子儀器廠；超凈工作臺，北京市西城區(qū)半導(dǎo)體設(shè)備一廠；DG-1多功能培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械修造廠；UV-120-02型分光光度計，日本島津；BH-2 顯微鏡，奧林巴斯（OLYMPUS）。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離篩選

1.3.1.1 乳酸菌分離與純化 從市售泡菜中取出5mL泡菜汁，和45mL無菌生理鹽水混勻，以10倍梯度稀釋， 選取 10-3、10-4、10-5三個稀釋度，各稀釋度取0.2 mL分別均勻涂布于MC培養(yǎng)基平板上，30℃平板倒置培養(yǎng)48 h，選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣圈的單菌落進行培養(yǎng)和保存。對分離的菌株在含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，劃線分離純化1～3次，挑取溶鈣圈明顯的單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種。將革蘭氏染色呈陽性和過氧化氫酶試驗為陰性的分離純化菌株，使用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用《微生物學(xué)實驗教程》中甘油法進行保藏（周德慶等，2013）。

1.3.1.2 乳酸菌篩選 乳酸菌初篩，將上述分離純化的菌株活化后，按體積比5%接種量（菌種活菌數(shù)約為1.0×108cfu/mL）接入MRS液體培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行產(chǎn)酸量測定，采用酸堿滴定法中和法，用0.1mol/L NaOH溶液滴定，計算產(chǎn)酸量。產(chǎn)酸量以吉爾涅爾度（°T）表示，每100 mL培養(yǎng)液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液記為1°T。乳酸菌復(fù)篩，將初篩選出的菌株培養(yǎng)液按重量比為0.5%的接種量 （菌種活菌數(shù)約為1.0×109cfu/mL），接種在預(yù)處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，分別均勻噴灑到500 g青筍葉，500 g白菜葉中，裝袋后壓實，袋口密封，在30℃下發(fā)酵，在一定時間測定尾菜青貯飼料pH及乳酸菌活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)評價復(fù)篩出發(fā)酵性能良好的乳酸菌（黃曉晗，2013；劉建新等，1999）。

1.3.2 菌種鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征觀察 將篩選出的菌株分別涂布到MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征，取典型菌落涂片，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，方法參見 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠等，2001）。

1.3.2.2 API 50CH試劑條鑒定 采用API 50CH（REF 50300）試劑條，對篩選出的乳酸菌進行鑒定。按照試劑條說明書操作，將接菌后的試劑條放入培養(yǎng)盒后，置于30℃條件下培養(yǎng)，記錄每個試劑條在24、48 h的顏色變化，將結(jié)果記錄于報告單，形成試驗菌株生化反應(yīng)譜，經(jīng)APIWEB軟件分析獲得被鑒定菌株的鑒定結(jié)果。

1.3.3 乳酸菌培養(yǎng)

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度對乳酸菌生長的影響 將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為 30、33、35、37、40、42 ℃， 使用MRS液體培養(yǎng)基，按照體積比5%的接種量接入種子液，靜置培養(yǎng)24 h，在600 nm條件下測定菌液的OD值，確定出篩選菌株生長的最適培養(yǎng)溫度。

1.3.3.2 培養(yǎng)基初始pH對乳酸菌生長的影響用1 mol/L的鹽酸或6 mol/L的氫氧化鈉將MRS液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，按照體積比5%接種量接入種子液，靜置培養(yǎng)24 h，在600 nm條件下測定菌液的OD值，確定出培養(yǎng)基最適初始pH。

1.3.3.3 接種量對乳酸菌生長的影響 將接種量分別設(shè)定為體積比 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，使用MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，在600 nm條件下測定菌液的OD值，確定出最適接種量。

1.3.3.4 生長曲線繪制 將菌株進行活化培養(yǎng)，按選出的最適溫度、初始pH和接種量，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取發(fā)酵液菌液，在600 nm條件下測定菌液的OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.4.1 發(fā)酵菌液活菌數(shù)測定 取1mL待測定發(fā)酵菌液，用稀釋液進行10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2mL菌懸液置于MRS瓊脂平板上，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)，每個稀釋梯度做3個平行，計數(shù)方法參見《GB4789.2-2010食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（中華人民共和國衛(wèi)生部，2010）。

1.3.4.2 尾菜青貯飼料中乳酸菌總數(shù)測定 取5 g尾菜青貯飼料和45 mL無菌生理鹽水混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-5、10-6稀釋梯度，吸取0.2mL菌懸液用涂布器涂布于MC瓊脂平板上，培養(yǎng)48 h后，選擇菌落顯紅色、周圍有明顯溶鈣環(huán)的菌落進行計數(shù)。

1.3.5 尾菜青貯菌劑制備 將試管活化的復(fù)篩出的乳酸菌菌種，按照體積比5%接種量接入500mL三角瓶進行種子液培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12 h。將三角瓶種子液按體積比5%的接種量接入5 L立瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液pH低于5.5時用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH至6.0～6.5。在調(diào)控pH培養(yǎng)液的生長曲線達到最高值時，終止發(fā)酵，進行菌落計數(shù)確定發(fā)酵培養(yǎng)液活菌數(shù)大于 1.0×109cfu/mL。

1.3.6 尾菜青貯菌劑菌株配比試驗 將復(fù)篩出的2 株乳酸菌菌株發(fā)酵培養(yǎng)液按活菌數(shù) 1∶1、2∶1、1∶2比例進行配比，按照重量比0.5%接種量接種到廢棄白菜葉裝袋壓實封口，每組3個平行，置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃青貯發(fā)酵，分別于 0 d至10 d每天取樣，測定各袋取樣樣品的pH。

1.3.7 尾菜青貯發(fā)酵試驗 將制備的尾菜青貯菌劑按重量比0.5%的量，分別均勻噴灑在5000 g青筍葉，5000 g白菜葉中，裝入單向排氣閥青貯袋中，裝袋后壓實、袋口密封，在30℃下發(fā)酵7 d，測定尾菜青貯飼料pH及乳酸菌活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)評價青貯菌劑的發(fā)酵性能（董妙音等，2016；楊艷等，2014；李勇等，2007）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選

清代是中國古典園林發(fā)展成就最大也是最后一個時期，清代皇家園林則是中國皇家園林的巔峰。清代皇家園林從康熙年間興起，至乾隆時期達到高潮，主要分布于北京西北郊和承德等地，分為宮城園林和離宮園林兩類。⑤宮城園林包括西苑三海、景山以及紫禁城內(nèi)的御花園、建福宮花園、慈寧宮花園和寧壽宮花園(即乾隆花園)6處;離宮園林包括北京西北郊的三山五園、南郊的南苑、承德的避暑山莊和薊縣的靜寄山莊等8處。

2.1.1 分離純化 本研究從采購的市售泡菜進行乳酸菌分離純化，從MC培養(yǎng)基選擇菌落顯紅色、周圍有明顯溶鈣圈的單菌落進行保存，對分離的菌株在含有CaCO3的MRS平板培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，挑選出溶鈣圈明顯的單菌落，經(jīng)鏡檢后確認(rèn)為純種，最終分離獲得20株產(chǎn)酸菌株。

2.1.2 初篩 青貯要求在較短時間內(nèi)青貯基質(zhì)pH迅速下降到4.0以下，這樣才能有效抑制真菌及其他雜菌的生長，因此，產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)。對分離純化獲得的20株菌株進行產(chǎn)酸速率試驗，將初篩到的菌株在MRS培養(yǎng)液30℃靜置培養(yǎng)24 h，進行產(chǎn)酸量測定，由圖 1 可以看出，菌株 SD2、SD4、SD14、SD16、SD17酸度均大于或等于70°T，其中SD2、SD4產(chǎn)酸量較高，酸度達到75°T以上，對初篩出的5株產(chǎn)酸性能較好的菌株作進一步研究。

圖1 菌株產(chǎn)酸能力測定結(jié)果

2.1.3 復(fù)篩 將初篩選出菌株接種在預(yù)處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，測定尾菜青貯飼料pH值及乳酸菌活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)篩選出發(fā)酵性能良好菌株，結(jié)果見表1，從感官指標(biāo)、pH、乳酸菌活菌數(shù)量比較可見，菌株SD2、SD4發(fā)酵廢棄白菜葉、青筍葉，發(fā)酵7 d后，尾菜青貯飼料pH均低于4.0，乳酸菌活菌數(shù)大于1.0×108cfu/g，顏色、氣味、質(zhì)地等感官指標(biāo)良好，適用于尾菜青貯飼料的發(fā)酵。

表1 不同菌株青貯尾菜評價

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 對篩選出的菌株SD2、SD4進行菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察，菌株SD2在MRS瓊脂平板上，菌落顯灰白色、圓形、凸起、表面平滑、濕潤、邊緣整齊，直徑2～3 mm，顯微鏡油鏡觀察，菌體呈長桿狀、單個、成對或成短鏈，革蘭氏染色陽性。菌株SD4在MRS瓊脂平板上，菌落顯微白色、圓形、扁平、濕潤、邊緣不規(guī)則，直徑為1～2 mm，顯微鏡油鏡觀察，細(xì)胞短桿狀、單個、成對或鏈狀排列，革蘭氏染色陽性。

2.2.2 API試劑條鑒定 API 50CH采用50個生化試驗對微生物的碳水化合物的代謝進行研究，API 50CH與API 50CHL培養(yǎng)基配合使用，用以鑒定乳酸桿菌，對篩選出的菌株SD2、SD4經(jīng)過API 50CH試劑條鑒定，結(jié)果見表2。從菌株菌落、菌體形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)合API 50CH鑒定結(jié)果，SD2最終鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），SD4最終鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lacto-bacillus fermentum）。

表2 API50CH鑒定

2.3 培養(yǎng)條件研究

2.3.1 培養(yǎng)溫度對篩選菌株SD2、SD4生長的影響將SD2、SD4分別接種在盛放MRS液體培養(yǎng)基200mL的500mL三角瓶中，置于不同溫度下靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD值，結(jié)果如圖2，菌株SD2在35℃下，培養(yǎng)液OD值較其他溫度下高，選擇35℃是菌株SD2最適生長溫度；菌株SD4在37℃下，培養(yǎng)液OD值較其他溫度下高，選擇37℃是菌株SD4最適生長溫度。

圖2 溫度對菌株生長影響

2.3.2 初始pH的影響 初始pH對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，將菌株SD2、SD4分別接種在不同初始pH的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD值，結(jié)果如圖3。由圖3可知培養(yǎng)基初始pH過高或過低均不利于菌株的生長。SD2在初始pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液OD值較其他初始pH條件下高，選擇pH 6.5是SD2最適生長初始pH；SD4在初始pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液OD值較其他初始pH條件下高，選擇pH 6.5是SD4最適生長初始pH。

圖3 初始pH對菌株生長的影響

2.3.3 不同接種量對篩選菌株SD2、SD4生長的影響 將菌株SD2、SD4分別按不同接種量接種在MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD值，結(jié)果如圖4。由圖4可知不同接種量對菌株的生長影響不同，因此選擇培養(yǎng)液OD值最高的為最適接種量。菌株SD2在6%接種量下，培養(yǎng)液OD值較其他接種量高，選擇6%接種量是菌株SD2最適生長接種量；菌株SD4在6%接種量下，培養(yǎng)液OD值較其他接種量高，選擇6%接種量是菌株SD4最適生長接種量。

圖4 接種量對菌株生長的影響

2.3.4 最適條件培養(yǎng) 菌株SD2在35℃下按6%接種量接種到初始pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，由圖5可見菌株SD2培養(yǎng)約10 h進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)20 h后進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)液的pH變化趨勢與菌體生長相符合，在菌體的對數(shù)生長期大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH迅速下降，培養(yǎng)20 h后培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在約3.4。菌株SD4在37℃下按6%接種量接種到初始pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，由圖6可見菌株SD4培養(yǎng)約8 h進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)16 h后進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)液的pH變化趨勢與菌體生長相符合，在菌體的對數(shù)生長期大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH迅速下降，培養(yǎng)16 h后培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在約3.6。

圖5 菌株SD2生長曲線與pH變化

圖6 菌株SD4生長曲線與pH變化

2.4 最適收獲期 乳酸桿菌在生長繁殖過程中分解代謝產(chǎn)生酸，隨著酸度升高，pH下降，乳酸桿菌的生長受到抑制。為了促進乳酸桿菌的生長和繁殖，菌株SD2、SD4各自在5 L立瓶培養(yǎng)過程中，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出各自調(diào)節(jié)pH組和對照組的生長曲線。菌株SD2生長曲線見圖7，菌株SD4生長曲線見圖8。菌株SD2、SD4調(diào)節(jié)pH組的活菌數(shù)明顯高于對照組。菌株SD2在24 h左右達到生長高峰期，因此選擇發(fā)酵培養(yǎng)24 h為菌株SD2的最佳收獲期，此時發(fā)酵液活菌數(shù)可達1.8×109cfu/mL；菌株SD4在20 h左右達到生長高峰期，因此選擇發(fā)酵培養(yǎng)20 h為菌株SD4的最佳收獲期，此時發(fā)酵液活菌數(shù)可達1.7×109cfu/mL。

圖7 植物乳桿菌SD2的生長曲線

圖8 發(fā)酵乳桿菌SD4的生長曲線

2.5 菌株配比 菌株SD2、SD4的發(fā)酵液按照活菌數(shù) 1∶1、2∶1、1∶2 比例進行配比， 按照重量比0.5%接種量接種到廢棄白菜葉，由圖9可知菌株SD2、SD4間不同的配比，其pH變化趨勢不同，產(chǎn)生了不同的發(fā)酵結(jié)果。在發(fā)酵初期，各處理的pH相近，在發(fā)酵7 d后到pH變化均趨于穩(wěn)定。菌株SD2、SD4配比為2∶1的青貯試驗pH最低，其pH值下降速率也最快，在4 d時pH下降至4.0以下，7 d后下降緩慢，基本趨于穩(wěn)定。因此，當(dāng)菌株SD2、SD4活菌數(shù)的配比為2∶1時，充分發(fā)揮了協(xié)同作用，能快速啟動青貯發(fā)酵，產(chǎn)生大量的有機酸使pH迅速降低，最后穩(wěn)定在3.7左右，可實現(xiàn)尾菜青貯飼料的長期保存。

圖9 菌株不同配比青貯過程中的pH變化

2.6 青貯效果評價 菌株SD2、SD4活菌數(shù)的配比為2∶1，按重量比0.5%接種量分別噴灑到廢棄白菜葉和廢棄青筍葉中，通過目測、嗅聞、手感感官檢驗、pH測定和活菌數(shù)計數(shù)，判斷青貯飼料發(fā)酵效果。結(jié)果見表3，制備的尾菜青貯劑接種廢棄白菜葉、廢棄青筍葉發(fā)酵7 d后發(fā)酵效果較好，pH均小于4.0，達到了較長期保存尾菜的要求。其中青貯廢棄白菜葉顏色淡黃色，酸香味濃郁，質(zhì)地較松散、柔軟、不發(fā)黏，7 d后pH為3.70，乳酸菌總數(shù)達到3.6×108cfu/g；青貯廢棄青筍葉，顏色黃綠色，酸香味濃郁，質(zhì)地松散、柔軟、不發(fā)黏，7 d后pH為3.85，乳酸菌總數(shù)達到3.3×108cfu/g。使用試制的尾菜青貯劑對廢棄白菜葉、青筍葉進行青貯發(fā)酵試驗，菌株SD2與菌株SD4共同作用青貯發(fā)酵效果良好。

表3 尾菜青貯劑發(fā)酵尾菜結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 從泡菜中分離篩選出適合尾菜青貯的乳酸菌，通過產(chǎn)酸性試驗與尾菜青貯發(fā)酵試驗篩選出SD2、SD4兩株產(chǎn)酸能力強，青貯廢棄白菜葉、青筍葉效果良好的菌株，在30℃進行尾菜青貯發(fā)酵7 d后，尾菜青貯飼料pH均低于4.0，尾菜青貯飼料乳酸菌活菌數(shù)大于1.0×108cfu/mL。

3.2 菌株SD2在MRS液體培養(yǎng)基中最適培養(yǎng)溫度35℃，最適培養(yǎng)基初始pH 6.5，接種量6%。菌株SD4在MRS液體培養(yǎng)基中最適培養(yǎng)溫度37℃，最適培養(yǎng)基初始pH 6.5，接種量6%。菌株SD2、SD4在最適條件下培養(yǎng)20 h后發(fā)酵液pH均能下降到pH 3.5以下，具有良好的青貯潛能。

3.3 對篩選獲得的菌株SD2、SD4經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，API 50CH試劑條鑒定，菌株SD2鑒定為植物乳桿菌，菌株SD4鑒定為發(fā)酵乳桿菌。

3.4 菌株SD2在MRS培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)，通過調(diào)控pH，24 h左右活菌數(shù)達到最大值，發(fā)酵液活菌數(shù)可達1.8×109cfu/mL。菌株SD4在MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，通過調(diào)控pH值，20 h左右活菌數(shù)達到最大值，發(fā)酵液活菌數(shù)可達1.7×109cfu/mL。

3.5 菌株SD2與菌株SD4活菌數(shù)配比為2∶1，30℃青貯白菜在4 d后pH下降至4.0以下，7 d后基本趨于穩(wěn)定。