杜鑫

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川 南充 637000)

恩拉霉素(enramycin)是由放線菌發(fā)酵而制得的一類具有環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)的飼用抗生素，是由不同種類的氨基酸分子和脂肪酸所組成的有機堿[1].據(jù)其環(huán)狀結(jié)構(gòu)末端脂肪酸種類，恩拉霉素主要分為恩拉霉素 A(C107H138C12N26O31)和恩拉霉素B (C108H140C12N26O31)，其對革蘭陽性菌有很強的抑制作用，尤其對腸道有害菌梭菌有特效，具有穩(wěn)定性高、低毒、低殘留，不易產(chǎn)生耐藥性等特點[2-3].恩拉霉素常作為禽、豬和魚的抗生素促生長劑，只需要添加微量就可呈現(xiàn)優(yōu)良的促生長及改進(jìn)飼料利用率的作用，是許多國家推薦的動物促生長劑和良好的飼料添加劑[1-5].然而，飼養(yǎng)者為了追求產(chǎn)量，往往超量應(yīng)用添加，造成動物產(chǎn)品中有害化學(xué)殘留日益嚴(yán)重，威脅人類健康.

目前，恩拉霉素檢測主要有微生物檢測法[2，6-7]，但只適用于測定恩拉霉素的酶活力，無法準(zhǔn)確定性及定量；曾玉勤等[8]采用HPLC法測定了預(yù)混劑中恩拉霉素的含量，線性范圍為12.5～200.0 mg·L-1，但不適用于“殘留低”特性的恩拉霉素檢測.本文基于液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)[9-12]，建立了雞肉中恩拉霉素殘留量檢測方法.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

恩拉霉素A (95%)和恩拉霉素B (85%)標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Boc Sciences公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級，購自Fisher公司；濃鹽酸(優(yōu)級純)購于成都科倫藥業(yè)公司.

超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters，UPLC Xevo TQ-S)，高速勻漿機(IKA，T25)，搖床(IKA，HS501)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，高速冷凍離心機(Sigma，3-18KS)，精密電子天平(Mettler Toledo，ML104T/02),氮吹儀(Organomation，N-EVAP112)， 固相萃取裝置(Agilent)，固相萃取小柱(Waters Oasis HLB，500 mg/6mL)，玻璃纖維濾紙(Whatman，0.7 μm，Φ 125 mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，50 mL離心管(Eppendorf)以及針孔式微孔濾膜(津騰PTFE，0.22 μm)等.

1.2 樣品提取

雞肉組織切碎，高速均質(zhì)后，稱取(2.00±0.05) g雞肉樣品于50 mL離心管中，加入10 mLV(甲醇)∶V(0.1 mol·L-1鹽酸)=5∶5溶液，漩渦振蕩10 min，低溫離心機10 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，殘渣再重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，50 ℃氮吹吹至無有機相.用0.1 mol·L-1鹽酸溶液定容至15.00 mL，渦旋混勻，低溫離心機10 000 r·min-1離心10 min后，取上清液用玻璃纖維濾紙過濾，濾液收集后待凈化.

1.3 樣品凈化

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水及5 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液活化，取待凈化濾液10.00 mL過柱，待樣品液全部流出后，用5 mLV(甲醇) ∶V(水)=5∶95淋洗，抽干.用5 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹干，加入2.00 mLV(甲醇)∶V(0.1 mol·L-1鹽酸)=5∶5溶液定容，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，待上機檢測.

1.4 儀器檢測條件

表1 UPLC流動相梯度洗脫程序

色譜條件：色譜柱為Waters XBridge C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，3.5 μm)；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：16 ℃；進(jìn)樣量：5 μL.流動相：甲醇(A)+體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液(B)+乙腈(C)；超高效液相色譜儀(UPLC)流動相梯度洗脫程序見表1.

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源為正離子(Positive electrospray ionization,ESI+)模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring,MRM).毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑氣(高純氮氣)溫度為500 ℃，其流量為1000 L·h-1，錐孔氣(高純氮氣)流量為150 L·h-1，碰撞氣(高純氬氣)流量0.10 mL·min-1，儀器Intellistart智能優(yōu)化功能得出的儀器參數(shù)見表2.

表2 恩拉霉素的儀器檢測參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

為減少基質(zhì)對電噴霧離子化效率及離子信號強度的影響，提高準(zhǔn)確性，配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來補償基質(zhì)效應(yīng).將恩拉霉素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用雞肉空白基質(zhì)溶液稀釋成濃度為10.00、20.00、50.00、100.00、150.00、200.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)中儀器條件依次進(jìn)樣，以恩拉霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合得出回歸方程和線性相關(guān)系數(shù).在目標(biāo)物最低質(zhì)量濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品，測定其響應(yīng)信號，用Masslynx V4.1軟件計算信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)，以S/N=10作為方法定量下限(The limits of quantification,LOQ)，以S/N=3作為方法檢出限(Limit of detection,LOD).

1.6 準(zhǔn)確度和精密度

選取空白雞肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，以測定濃度平均值(Average,AVG.)與參照值的百分比來表示方法準(zhǔn)確度，以測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)表示精密度.向空白雞肉樣品中加入10.00、100.00及200.00 μg·kg-13個濃度水平的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平設(shè)6 個平行質(zhì)控樣品，所有樣品均采用1.2和1.3節(jié)方法進(jìn)行提取和凈化，按1.4節(jié)儀器檢測條件測定藥物濃度.

1.7 日內(nèi)和日間精密度

依次向雞肉空白樣品中加入低、中、高3個濃度的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度設(shè)6個平行質(zhì)控樣品.對樣品進(jìn)行提取和凈化上機檢測，連續(xù)測定3 d，根據(jù)每天隨行測定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的實測濃度，即可計算本方法的日內(nèi)和日間精密度，從而衡量測定結(jié)果的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

因雞肉中含有大量的油脂等干擾物，在試樣前處理過程，創(chuàng)新性地采用玻璃纖維濾紙過濾提取液中的脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，除去了樣品中的大量干擾物，有效解決了樣品提取液堵塞HLB小柱問題，提高了柱效和凈化效果，減小基質(zhì)干擾.

2.2 方法選擇性

恩拉霉素采用反相液相色譜法分離，減少了共流出物，有效降低了目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng).在流動相中加入0.1%的甲酸(體積分?jǐn)?shù))有助于分析物預(yù)形成[M+H]+，從而提高電噴霧離子源在ESI+模式下的離子化效率，抑制基質(zhì)干擾，提高了方法選擇性和靈敏度.從恩拉霉素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜、雞肉空白樣品圖譜和雞肉加標(biāo)樣品圖譜(圖1-圖3)中可以看出，恩拉霉素A和恩拉霉素B的保留時間分別為3.55 min和3.60 min，目標(biāo)物均有較強的分子離子峰強度，峰形及分離度均良好，且沒有前沿峰和拖尾峰，雞肉空白基質(zhì)響應(yīng)信號不干擾樣品中恩拉霉素的測定.

圖1 恩拉霉素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(10.00 μg·L-1)

圖2 雞肉空白樣品圖譜

圖3 雞肉加標(biāo)樣品圖譜(10.00 μg·kg-1)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

恩拉霉素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線在10.00～200.00 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998 2，計算得到方法檢測雞肉中藥物的LOQ和LOD，結(jié)果見表3，恩拉霉素藥物的LOQ和LOD分別為10.00 μg·kg-1和4 μg·kg-1.

表3 恩拉霉素檢測的線性范圍、r、LOQ和LOD

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

在試驗條件下所得結(jié)果見表4，恩拉霉素檢測的準(zhǔn)確度為72.41%～84.47%，RSD為3.02%～4.48%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度.

表4 方法的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.5 日內(nèi)和日間精密度

在試驗條件下，雞肉中恩拉霉素在日內(nèi)和日間測定值的RSD均小于5.29%(見表5)，表明方法具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，測定結(jié)果可靠.

表5 雞肉中恩拉霉素的日內(nèi)和日間精密度

3 結(jié) 論

建立了采用HLB柱固相萃取凈化， UPLC-MS/MS測定雞肉中恩拉霉素殘留量的方法.創(chuàng)新性地使用玻璃纖維濾紙來初步過濾提取液中的蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，有效解決了柱子堵塞問題.采用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法來排除復(fù)雜基質(zhì)干擾，減小基質(zhì)效應(yīng)，極大地提高了方法的選擇性、靈敏度、準(zhǔn)確度及精確度等指標(biāo)，符合動物源食品中獸藥殘留檢測的方法學(xué)要求，可為該類抗生素后續(xù)實踐過程中殘留監(jiān)控質(zhì)量控制提供技術(shù)參考.