趙淵，高松，劉連盟，黎起秦，黃世文*

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530003； 2.中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室，浙江 杭州 310006；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，河南 鄭州 450002)

水稻惡苗病是由藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi)侵染引起的一種真菌病害[1-3]。藥劑種子處理是目前唯一可以依靠的防治該病的有效手段[4-6]。咪鮮胺是防控水稻惡苗病的主要藥劑，在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。近年來，由于抗性問題嚴(yán)重，咪鮮胺的藥效降低，用量逐年加大[7-9]。

20世紀(jì)70—80年代，國內(nèi)外接連報道發(fā)現(xiàn)苯菌靈抗性菌株，此時距苯并咪唑類殺菌劑大規(guī)模用于水稻惡苗病防治僅僅十幾年時間[10]。據(jù)日本有關(guān)報道，20世紀(jì)80年代末到90年代初，對日本8個地區(qū)9個縣采集的病樣進行抗性測定，發(fā)現(xiàn)惡苗病菌對苯并咪唑類藥物的抗性已達很高水平，其中，最低抑菌濃度(MIC)≥100 mg·kg-1的菌株占83.4%[11-12]。在我國，鎮(zhèn)江農(nóng)科所于1990—1992年連續(xù)3 a分別對全國4省市共16個縣采集的菌株進行苯并咪唑類藥物抗性測定，結(jié)果表明，MIC≥100 mg·kg-1菌株占所采集菌株的65.9%，抗性菌株已成為這些地區(qū)的優(yōu)勢種群[13]。目前，我國水稻惡苗病菌對多菌靈的抗性問題已經(jīng)非常普遍，局部地區(qū)的抗性水平已達5 000倍以上[14]。

20世紀(jì)90年代，日本幾家大型農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)均分離到了對咪唑類農(nóng)藥不敏感的菌株，這距咪鮮胺的大面積推廣應(yīng)用尚不足十年[15]。趙志華等[16]研究表明，水稻惡苗病菌對咪鮮胺具有潛在的抗性風(fēng)險；劉永鋒等[17]研究表明，江蘇省的田間惡苗病菌對咪鮮胺已有一定的抗性；陳夕軍等[18]分離到了8株抗咪鮮胺的惡苗病菌，且均有很高的抗性水平；鄭睿等[19]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇省分離得到的水稻惡苗病菌株對咪鮮胺全部達到了中抗和高抗藥性水平，其中高抗咪鮮胺的菌株占比已達76.62%，說明咪鮮胺高抗藥性菌株已經(jīng)成為江蘇省惡苗病菌的優(yōu)勢群體。

目前，我國水稻惡苗病咪鮮胺抗性研究以江蘇省為主，浙江省相關(guān)報道不多。本研究自浙江省杭州市富陽區(qū)采集水稻惡苗病菌株，對其咪鮮胺敏感性進行檢測，以期初步探明當(dāng)?shù)厮緪好绮【鷮漉r胺的抗性水平，為生產(chǎn)上合理用藥及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻惡苗病病原菌分離

取水稻惡苗病發(fā)病莖稈，剪成0.5 cm左右的小段，在0.1%升汞溶液中浸泡消毒1 min，75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水漂洗3次后，放在添加硫酸鏈霉素的水-瓊脂培養(yǎng)基(WA)上，每個標(biāo)本放在一個培養(yǎng)皿里，28 ℃培養(yǎng)至有菌絲產(chǎn)生。挑取菌絲尖端，轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，培養(yǎng)直至產(chǎn)孢，經(jīng)單孢分離后，得到水稻惡苗病菌株。

1.2 咪鮮胺對各菌株的毒力測定

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1156.2—2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則 殺菌劑 第2部分：抑制病原真菌菌絲生長試驗 平皿法》測定咪鮮胺對各菌株的毒力，略有改動。在無菌操作條件下，根據(jù)試驗處理將預(yù)先融化的滅菌培養(yǎng)基定量(一般為90 mL)加入無菌錐形瓶中，從低濃度到高濃度依次定量吸取藥液，分別加入上述錐形瓶中，充分搖勻。然后等量倒入3個以上直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。試驗設(shè)不含藥劑的處理作空白對照，每個處理不少于3個重復(fù)。將培養(yǎng)基培養(yǎng)的惡苗病菌(菌齡5 d左右)，在無菌條件下用直徑5 mm的滅菌打孔器自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接于含藥平板中央，菌絲面朝上，蓋上皿蓋，置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后調(diào)查病原菌菌絲生長情況。用卡尺測量菌落直徑(mm)。每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各一次，計算各處理濃度對供試靶標(biāo)菌的菌絲生長抑制率(%)。

1.3 水稻惡苗病菌的抗藥穩(wěn)定性

在獲得咪鮮胺對各菌株半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的基礎(chǔ)上，分別選擇3個敏感菌株和4個高抗藥性菌株，接種PDA平板，每2～3 d轉(zhuǎn)接一次，稱為一代。分別測定咪鮮胺對轉(zhuǎn)接5、10、20代后敏感菌株和高抗藥性菌株的EC50。

1.4 水稻惡苗病菌對咪鮮胺和其他殺菌劑的交互抗性

在獲得咪鮮胺對各菌株EC50的基礎(chǔ)上，分別選擇2個敏感菌株和2個高抗藥性菌株。分別測定嘧菌酯、多菌靈和戊唑醇對以上4個菌株的EC50，分析咪鮮胺和上述3種殺菌劑的交互抗性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用DPS v9.0.5數(shù)據(jù)分析軟件，根據(jù)各藥劑濃度對數(shù)值及對應(yīng)的菌絲生長抑制率作回歸分析，計算各藥劑的EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻惡苗病菌標(biāo)本的采集和分離

共采集水稻標(biāo)本106份，包括水稻品種60種以上，分離得到單孢菌株85株。

2.2 水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性

通過菌絲生長抑制法測定85個水稻惡苗病菌株的EC50(圖1)，值域為0.012～0.620 mg·kg-1，敏感性相差51倍，但多數(shù)菌株的EC50在0.05～0.10 mg·kg-1。

圖1 各菌株EC50的分布

2.3 水稻惡苗病菌株的抗藥穩(wěn)定性

選取3個最敏感菌株和4個抗藥性最強的菌株，分別轉(zhuǎn)代培養(yǎng)5、10、20次，開展抗藥穩(wěn)定性測試。結(jié)果(表1)表明，敏感菌株的EC50隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)升高差異并不明顯，說明敏感菌株在無藥劑選擇壓力的情況下，敏感性保持穩(wěn)定；而高抗藥性菌株對咪鮮胺的抗性隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)提高呈明顯下降趨勢，其中，CR074轉(zhuǎn)接20代后，其EC50從0.530 mg·kg-1下降到0.370 mg·kg-1，其他3個高抗藥性菌株轉(zhuǎn)接20代后，EC50仍維持在0.400 mg·kg-1。上述結(jié)果表明，水稻惡苗病菌對咪鮮胺的抗藥性并不穩(wěn)定，在無咪鮮胺選擇壓力的情況下，其抗藥性可隨著菌株的自然繁殖而逐漸降低，但這需要相當(dāng)長的時間。

表1 水稻惡苗病菌株對咪鮮胺抗藥性的穩(wěn)定性

2.4 水稻惡苗病菌對咪鮮胺和其他殺菌劑的交互抗性

從表2可以看出，咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對嘧菌酯的EC50分別為0.71、0.45、0.52、0.24 mg·kg-1，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺和嘧菌酯無交互抗性。咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對多菌靈的EC50分別為1.71、1.45、1.61、1.42 mg·kg-1，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺和多菌靈亦無交互抗性。咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對戊唑醇的EC50分別為0.037、0.024、0.080、0.110 mg·kg-1，咪鮮胺高抗藥性菌株對嘧菌酯的EC50明顯高于咪鮮胺敏感菌株，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺和戊唑醇有交互抗性。

表2 水稻惡苗病菌株對咪鮮胺及其他 殺菌劑的EC50 mg·kg-1

3 討論

目前，已有多個關(guān)于水稻惡苗病菌株對咪鮮胺的敏感性研究，但是研究結(jié)果差異很大，可能與培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素有關(guān)。EC50值并不是絕對的，它受很多因素的影響。本研究通過菌絲生長抑制法測定了85個水稻惡苗病菌株的EC50，值域在0.012～0.620 mg·kg-1。相對其他研究，本研究采樣范圍小，但樣本量大，得到單孢菌株85株。在本研究檢索范圍內(nèi)，還未見對小范圍的水稻惡苗病抗藥性分化的研究，本研究的完成可為小范圍內(nèi)水稻惡苗病菌及其他病菌抗藥性分化的研究提供參考。

殺菌劑的敏感性在長期停用同一作用類型的殺菌劑后，可以得到一定恢復(fù)，其恢復(fù)時間和恢復(fù)程度與病原菌對該類殺菌劑的抗性穩(wěn)定性有關(guān)[20]。水稻惡苗病菌對咪鮮胺的抗藥性并不穩(wěn)定，在無咪鮮胺選擇壓力的情況下，其抗藥性可隨著菌株的自然繁殖而逐漸降低，但這需要相當(dāng)長的時間。

作物病原菌對藥劑的交互抗性是指對一種殺菌劑有抗性的菌株，同時對另外幾種殺菌劑有抗性的現(xiàn)象。一般認(rèn)為同一作用機制的殺菌劑容易產(chǎn)生交互抗性。本研究表明，咪鮮胺和戊唑醇具有交互抗性，而與多菌靈和嘧菌酯無交互抗性。關(guān)于上述交互抗性機制，還有待于進一步研究。