王佳佳 馮文莉

(1.山西醫(yī)科大學，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001)

白念珠菌是一種常見的條件致病性真菌，常寄居于人體的皮膚黏膜，由于菌株毒力的增加、宿主免疫力降低、外部環(huán)境改變等因素可導致人體淺表真菌感染或系統(tǒng)性真菌感染[1]。通過對中國西南地區(qū)的念珠菌血癥患者進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)白念珠菌的感染比例為34.9%，是導致念珠菌血癥的主要菌種[2]。目前治療白念珠菌感染主要以唑類、多烯類、嘧啶類和棘白菌素類抗真菌藥物為主。但由于抗真菌藥的長期使用，臨床上可以見到許多抗真菌治療失敗的案例，分析其主要原因就是真菌耐藥性的增加。白念珠菌生物膜的形成是真菌藥耐藥性明顯增加的重要原因之一，有研究顯示，真菌生物膜比浮游細胞耐藥性高1000 倍左右[3]。

白念珠菌生物膜耐藥機制主要為[4]：細胞外基質作為一個物理屏障阻礙藥物的進入；生物膜內細胞活性下降，對抗真菌藥物不敏感；耐藥基因的表達增加，如外排泵基因CDR1和MDR1、麥角甾醇合成途徑中ERG11和ERG25等基因的表達量上調；生物膜內滯留菌的長期存在等，這些因素均可以導致白念珠菌生物膜耐藥性的增強。其中滯留菌在白念珠菌生物膜耐藥機制中的作用越來越突出。Fauvart等[5]發(fā)現(xiàn)臨床上出現(xiàn)許多慢性難治性感染，大部分與滯留菌的存在有關，滯留菌可以作為慢性難治性白念珠菌感染治療的一個新的突破點。此外，饑餓狀態(tài)下滯留菌的形成比例增加[12]，而且轉錄基因GCN4表達增加[15]，所以滯留菌的形成與轉錄基因GCN4可能具有一定的相關性。

1 滯留菌

白念珠菌滯留菌(Persister cells)是生物膜隨機產生的少量處于休眠狀態(tài)的酵母型細胞，數(shù)量約占0.1%～1%，它們對抗真菌藥物具有較強的耐受性，能夠在高濃度抗真菌藥物存在的條件下存活；當對滯留菌進行重新培養(yǎng)時，它可以重新構建相似比例的新生物膜，并具有相同的抗真菌藥物敏感性[6]。

1.1 滯留菌與耐藥性

白念珠菌生物膜耐藥機制十分復雜，滯留菌作為其中的一個重要機制，越來越引起大家的關注。Del Pozo等[7]發(fā)現(xiàn)最成熟的抗真菌藥耐藥機制是生物膜中的微生物亞群采用獨特的、高度保護的表型狀態(tài)，即滯留菌。滯留菌與耐藥菌有所不同：基因序列并沒有發(fā)生任何改變，耐藥性不會遺傳[8]。它可通過“休眠-生長-增殖”的方式應對不良環(huán)境，維持自身生存和菌體結構穩(wěn)定。Vogwill等[9]通過實驗發(fā)現(xiàn)滯留菌與耐藥菌之間代表的是一種互補的、而非競爭性的進化策略；當抗生素的暴露時間較長時，將有利于耐藥菌的產生；如果抗生素暴露時間短暫，將有利于滯留菌的產生。滯留菌處于持久性休眠狀態(tài)時，它幾乎不發(fā)生細胞壁合成、翻譯或產生拓撲異構酶活性，所以抗真菌藥物能夠與其結合但不破壞其靶分子的功能[7]。因此，與細菌中的滯留菌一樣，白念珠菌滯留菌表現(xiàn)出非遺傳性、多藥耐受性的特征，被認為是高抗生素耐藥性和真菌感染性疾病復發(fā)的主要決定因素[10]。

1.2 滯留菌與生物膜

滯留菌與生物膜之間存在密切的聯(lián)系。雖然浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下都能檢測到細菌性滯留菌[11]，但白念珠菌滯留菌迄今僅在生物膜中被觀察到[6]。國內研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)缺乏(饑餓狀態(tài))對白念珠菌生物膜形成具有一定影響[12]：對數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓態(tài)白念菌生物膜形成能力依次下降，且對數(shù)期和穩(wěn)定期形成菌絲相生物膜，饑餓狀態(tài)下形成酵母相生物膜；此外，給予抗真菌藥物作用后，滯留菌比例依次升高；說明饑餓狀態(tài)能夠形成酵母相生物膜，且提高滯留菌的產生比例。而且Sun等通過研究[13]，再次確認只有在生物膜中才能觀察到白念珠菌滯留菌，而浮游狀態(tài)完全沒有滯留菌的存在；并發(fā)現(xiàn)白念珠菌滯留菌主要在生物膜形成的表面黏附階段產生(生物膜形成的0～2 h)， 表明表面黏附是形成和維持白念珠菌滯留菌所必需的。

2 轉錄基因GCN4

GCN4(又名：CaO19.1358基因)是一種氨基酸饑餓應答轉錄因子，位于白念珠菌第2號染色體，長度約為1468個堿基對，它與啟動元件TGACTC相結合，參與了包括編碼氨基酸生物合成酶系各基因在內的表達調節(jié)[14]。大多數(shù)酵母在任何一種氨基酸饑餓的生長環(huán)境中均可激活GCN2，使eIF2磷酸化，抑制大多數(shù)蛋白質的生物合成，并特異性增強轉錄基因GCN4的合成[15]。

2.1 轉錄基因GCN4與耐藥性

白念珠菌的耐藥機制除了耐藥基因的表達增加外，還進化出了應激反應途徑，使細胞能夠應對環(huán)境中存在的各種壓力[16]，如氧化應激反應等。白念珠菌的氧化應激反應是由翻譯起始的氧化特異性調控介導的，Sundaram等[17]發(fā)現(xiàn)包括過氧化氫、重金屬鎘和硫醇氧化劑在內的氧化劑能夠抑制翻譯起始，且都以劑量依賴性的方式抑制白念珠菌的生長；除了抑制全部的翻譯起始外，eIF2a磷酸化還通過翻譯調控機制增強了酵母中GCN4mRNA的表達，對白念珠菌GCN4的產生有誘導作用，而且GCN4是白念珠菌對過氧化氫產生耐受性所必須的，所以GCN4在參與白念珠菌的氧化應激反應的同時，對白念珠菌的耐藥性也產生了影響。GCN4是一種參與氨基酸內部穩(wěn)態(tài)信號傳導的轉錄因子，與酵母中約70%的MFS-MDR轉運蛋白編碼基因的轉錄調控有關[18]。國外研究發(fā)現(xiàn)，酵母對苯甲酸的反應和耐受涉及到一種多耐藥轉運蛋白Tpo1，而它主要受轉錄因子GCN4和STP1的調控[19]。所以，轉錄基因GCN4與白念珠菌耐藥性密切相關。

2.2 轉錄基因GCN4與生物膜

氨基酸饑餓條件可以促進白念珠菌的形態(tài)發(fā)生變化，包括菌絲分化和生物膜的形成，從而影響白念珠菌毒力[20]。而GCN4作為一種氨基酸饑餓應答轉錄因子，在白念珠菌中誘導了兩個不同的過程來響應氨基酸饑餓：激活氨基酸生物合成和觸發(fā)形態(tài)變化[21]。Sundaram等[21]測試了白念珠菌gcn4/gcn4突變株與野生株在微發(fā)酵劑中形成生物膜的能力，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)充足的條件下，兩種菌株產生的生物膜總量及酵母和菌絲形成的比例相似，說明GCN4對生物膜的形成作用與觸發(fā)形態(tài)變化無關；而在營養(yǎng)不足造成氨基酸饑餓時，突變株的生物膜生長細胞比例明顯降低；證明氨基酸饑餓狀態(tài)下，生物膜的有效生長離不開轉錄因子GCN4。所以，氨基酸饑餓的條件下[22]，GCN4對生物膜形成的影響類似于GCN反應(GCN-like response,即激活氨基酸生物合成)，雖然在浮游生物種群沒有觀察到這種反應，但生物膜的情況可能有所不同，它們似乎對蛋白質合成的需求增加了，因此氨基酸限制可能出現(xiàn)地更快。在這些條件下，GCN4的調節(jié)作用對生物膜的形成起決定性作用。

3 滯留菌與轉錄基因GCN4的相互聯(lián)系

白念珠菌滯留菌和轉錄基因GCN4均與營養(yǎng)環(huán)境相關。如在饑餓狀態(tài)下，能夠提高白念珠菌滯留菌的產生比例；而且在營養(yǎng)缺乏的條件下，必然會造成氨基酸的相對不足，而在氨基酸饑餓狀態(tài)下，可以使轉錄基因GCN4表達量上調。

滯留菌的形成與環(huán)境的微妙變化相關[23]。在營養(yǎng)缺乏等不適宜生存的條件下，Li等[24]通過分析白念珠菌生物膜滯留菌基因和蛋白質表達譜，發(fā)現(xiàn)滯留菌的存在的原因可能是：能夠持久下調主要的能量生成途徑和蛋白質合成，并增強與應激反應有關的緊張性代謝活動和蛋白質表達。具體如：在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境下[24]，白念珠菌生物膜滯留菌通過抑制糖酵解和TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的催化酶，導致NADH的產生減少，并且通過電子傳遞鏈的氧化刺激超氧化物和下游ROS的產生，能夠持久下調主要的能量生成途徑；降低與蛋白質合成和細胞生長有關的高度保守蛋白質Tma19的表達；下調翻譯時促進多肽鏈延伸的主要延伸因子(如EF-1、EF-2)等?？傊@些數(shù)據(jù)表明白念珠菌生物膜的滯留菌似乎進入了代謝不活躍狀態(tài)以生存。此外，白念珠菌生物膜滯留菌還啟動主動應激反應。通過實驗發(fā)現(xiàn)[24]，應激反應所必需的許多蛋白質豐度的大幅度增加，表明白念珠菌生物膜滯留菌可能采取積極的防御策略來應對極端的抗真菌刺激，如主導表型轉換(如BMH1、RAS1和ASC1)，表面黏附(如ALS3、MP65和CSP37)，群體感應和細胞周期控制(如SMT3、SLK19和GRP2)的各種蛋白質的表達水平增加。這些調節(jié)蛋白的激活表明，白念珠菌生物膜滯留菌可能通過調節(jié)它們的生長以及與其他細胞的相互作用來為自我保護模式做好準備。

國內研究發(fā)現(xiàn)，在致死劑量的兩性霉素B的作用下，抑制核酸生物合成對白念珠菌生物膜內的滯留菌的形成影響不大[25]。國外發(fā)現(xiàn)，在進行關于大腸桿菌對氨基糖苷耐受性研究時，氨基酸生物合成有助于耐受慶大霉素的大腸桿菌滯留菌的形成[26]，而且在研究AldB(醛脫氫酶)根據(jù)環(huán)境壓力控制大腸桿菌滯留菌的形成時發(fā)現(xiàn)，同樣的菌株在氨基酸有限的條件下產生了更多的滯留菌[27]。GCN4作為一種氨基酸饑餓應答轉錄因子，在參與氨基酸生物合成的同時，也必然與滯留菌的形成相關。而且，Mittal等[28]發(fā)現(xiàn)GCN4抑制了整體翻譯水平，翻譯起始因子IFs和延伸因子EFs的豐度被降低，而氨基酸生物合成中涉及的多條通路都被顯著上調，通過分析各種酵母菌株的信使RNA和蛋白質豐度、核糖體占用率和蛋白質合成率，證明GCN4對白念珠菌滯留菌的存在有不可替代的作用，它可能減少了其他途徑的蛋白質合成，延長白念珠菌的壽命，使滯留菌能夠存活。

4 總 結

白念珠菌是一種常見的真菌病原體，常寄居于人體內，當人體免疫力降低、外部環(huán)境改變時可轉變?yōu)橹虏【瑥亩饻\表感染或系統(tǒng)性感染。滯留菌是處于非生長狀態(tài)的菌細胞，被認為是導致對多種藥物耐藥的主要原因，與臨床上許多慢性難治性感染息息相關。目前對于滯留菌引起的慢性難治性白念珠菌感染的治療尚處于探索階段，了解滯留菌的相關形成機制十分重要。在本文中對白念珠菌滯留菌與轉錄基因GCN4的關系的進行了分析，希望對了解滯留菌的形成機制有所幫助。白念珠菌滯留菌的抗真菌耐受性可能是由微妙的代謝調節(jié)和協(xié)調的壓力適應引發(fā)的，了解滯留菌對治療慢性難治性白念珠菌感染意義深遠。一旦滯留菌形成機制明朗，將推動滯留菌清除方面的研究，有助于新型抗真菌藥物的研發(fā)，由滯留菌引起的慢性難治性白念珠菌感染也將取得新的研究進展。