雷巖 方偉 張超 廖萬(wàn)清

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市醫(yī)學(xué)真菌研究所，上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，可在免疫功能低下的個(gè)體中引起致命的感染[1]。美國(guó)2018年感染性疾病學(xué)會(huì)指南指出：兩性霉素B與氟胞嘧啶依舊為隱球菌感染的首選治療藥物[2]。近年來(lái)隱球菌感染率逐年上升，即使應(yīng)用指南推薦藥物方案治療，死亡率仍在20%左右；臨床上不正規(guī)治療以及可用抗真菌劑數(shù)量有限等因素，也使得隱球菌耐藥率問(wèn)題越來(lái)越困擾著疾病治療與預(yù)后。

在抗隱球菌以及其他致病真菌的治療與研究中，抗真菌藥物的聯(lián)合使用常可以表現(xiàn)于廣譜性能更全面、減少耐藥性等積極作用[3]。此外抗真菌藥物聯(lián)合其他化合物時(shí)，可降低抗真菌藥物劑量，從而可增加藥物安全性與可耐受性[4]。故引入具有不同作用機(jī)制的新型抗真菌藥物使得聯(lián)合治療成為可能的同時(shí)，更是引人注目的研究新領(lǐng)域。

粗糠柴苦素(Rattlerin) 是一種從粗糠柴的果實(shí)中提取的多酚類化合物，它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，并可以干擾其轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)，已在腫瘤生物分子學(xué)領(lǐng)域得到廣泛研究。有相關(guān)研究表明，粗糠柴苦素通過(guò)影響莽草酸激酶抑制細(xì)胞外分枝桿菌；Roshan研究發(fā)現(xiàn)粗糠柴苦素對(duì)于人致病酵母和絲狀真菌有一定的抗真菌活性。目前尚無(wú)粗糠柴苦素聯(lián)合抗真菌藥物抗隱球菌體外藥敏的相關(guān)報(bào)道，本研究擬通過(guò)體外棋盤法聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)，測(cè)定粗糠柴苦素聯(lián)合氟康唑抗隱球菌是否有增效作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 本實(shí)驗(yàn)共使用50株菌株，均為上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)內(nèi)保存，其中念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株13株，隱球菌37株(標(biāo)準(zhǔn)株7株、臨床分離株15株、環(huán)境分離株14株、野生貓科分離株1株)，相關(guān)基因類型信息詳見表1，本藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌為近平滑念珠菌ATCC 22019。

培養(yǎng)基 SDA固體培養(yǎng)基，購(gòu)自科馬嘉公司；RPMI1640液體培養(yǎng)基(pH7.0)，購(gòu)自美國(guó)Gibro公司。

藥物 氟康唑(FLZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；粗糠柴苦素(Rattlerin)購(gòu)自英國(guó)TOCRIS公司。

溶劑 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；蒸餾水由日本凈水機(jī)生產(chǎn)。

表1 本研究菌株編號(hào)以及相關(guān)信息

(續(xù)表)

1.2 方法

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)提出的標(biāo)準(zhǔn)M27-A3以及補(bǔ)充方案M27-S4肉湯稀釋法指南，在30℃下培養(yǎng)上述50株菌48h后，使用96孔板(Costar)進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，后讀取抗真菌活性(MIC值)[7]。其中包括體外單藥藥敏實(shí)驗(yàn)(FLZ、RAT)，應(yīng)用棋盤式微量稀釋法方案進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)(FLZ+RAT)，以分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI)為判定標(biāo)準(zhǔn)，分析藥物相互作用。

單藥藥敏試驗(yàn)中，氟康唑以及粗糠柴苦素MIC值讀取方法與標(biāo)準(zhǔn)：在放大鏡觀測(cè)儀進(jìn)行視覺讀取，與陽(yáng)性對(duì)照孔相比較，酵母類真菌生長(zhǎng)≤50%的最低藥物濃度；聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中，MIC值讀取方法與標(biāo)準(zhǔn)：在放大鏡觀測(cè)儀進(jìn)行視覺讀取，與陽(yáng)性對(duì)照孔相比，酵母類真菌生長(zhǎng)≤50%的最低藥物濃度。本研究中，氟康唑與粗糠柴苦素藥物濃度范圍分別為64～0.5 μg/mL，256～0.25 μg/mL。

計(jì)算FICI以及效能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：FICI值=(聯(lián)合作用時(shí)A藥MIC值/單藥時(shí)A 藥MIC值)+(聯(lián)合作用時(shí)B藥MIC值/單藥時(shí)B藥MIC值)。當(dāng)FICI≤0.5時(shí) 判定兩種藥物存在協(xié)同作用；0.54.0時(shí)判定為拮抗作用。

2 結(jié) 果

檢測(cè)氟康唑?qū)?3株念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株以及37株隱球菌菌株的最低抑菌濃度范圍分別為2～32 μg/mL、1～16 μg/mL(見表2)；粗糠柴苦素對(duì)白念珠菌以及隱球菌具有一定的抗真菌作用，最低抑菌濃度范圍分別64～256 μg/mL、32～256 μg/mL(見表2)。應(yīng)用棋盤式微量稀釋法方案下，檢測(cè)氟康唑與粗糠柴苦素聯(lián)合作用對(duì)13株念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株以及37株隱球菌菌株的最低抑菌濃度分別為0.5～8 μg/mL、0.5～8 μg/mL(見表2)。根據(jù)FICI計(jì)算公式以及效能判定，所有菌株FICI≤0.50，即氟康唑與粗糠柴苦素聯(lián)合對(duì)所有菌株顯示協(xié)同作用，其中37株隱球菌菌株FICI范圍為0.07～0.50，中位數(shù)為0.312，聯(lián)合使用后，氟康唑的MIC值降低了50%～93.75%(見表2)。

表2氟康唑與粗糠柴苦素聯(lián)合對(duì)13株念珠菌、37株隱球菌的相互作用關(guān)系

Tab.2The effects of fluconazole and rattlerin on 13 strains ofCandidaand 37 strains ofCryptococcus

菌株單獨(dú)MIC50(μg/mL)聯(lián)合MIC50(μg/mL)FLZRATFLZRATFICI判定結(jié)果ATCC 2159321288320.50協(xié)同ATCC 106671612820.250.126協(xié)同ATCC 10671812810.50.129協(xié)同ATCC 140531612820.250.127協(xié)同ATCC 200264640.520.156協(xié)同ATCC2201926410.250.50協(xié)同ATCC 282264640.520.156協(xié)同ATCC 6602921280.520.156協(xié)同ATCC 90018225610.250.50協(xié)同ATCC MYA-2876812820.250.25協(xié)同CMCC(F)C1621280.580.312協(xié)同CMCC(F)C2f212810.50.50協(xié)同CMCC(F)Y10b412810.50.25協(xié)同CBS105718128240.28協(xié)同SC5314162561320.1875協(xié)同H99832220.126協(xié)同SCZ201618128280.3125協(xié)同SCZ20163161284160.375協(xié)同SCZ20164812840.250.50協(xié)同SCZ2016541280.50.250.50協(xié)同SCZ2016611280.50.250.50協(xié)同SCZ2016746420.250.50協(xié)同SCZ201681664480.375協(xié)同SCZ201694128120.266協(xié)同SCZ201701625680.250.50協(xié)同SCZ2017346420.250.50協(xié)同SCZ2017416256410.254協(xié)同SCZ20175212810.250.50協(xié)同SCZ2017612560.50.250.50協(xié)同SCZ2017712560.50.250.50協(xié)同SCZ201784640.520.156協(xié)同SCZ201791640.50.250.50協(xié)同SCZ201818256240.27協(xié)同SCZ201828640.50.250.07協(xié)同SCZ2018316128440.28協(xié)同

(續(xù)表)

注：FLZ：氟康唑；RAT：粗糠柴苦素

3 討 論

近年來(lái)，隨著HIV感染、惡性腫瘤、放療化療、器官或干細(xì)胞移植以及自身免疫性疾病在內(nèi)的免疫功能低下人群的數(shù)量不斷增加，廣譜抗生素的濫用，免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用，以及導(dǎo)管介入等新型治療操作技術(shù)的不斷拓展，侵襲性真菌感染的發(fā)病率以及病死率迅速上升，其中包括隱球菌病。面對(duì)這樣嚴(yán)峻的臨床考驗(yàn)，現(xiàn)如今可供參考與普及的抗隱球菌感染藥物卻依舊有限，在以唑類為代表的傳統(tǒng)抗真菌藥物長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床的現(xiàn)狀，耐藥菌株的出現(xiàn)已成為臨床治療隱球菌病失敗的最主要原因[1, 16]。中國(guó)大多數(shù)人口居住在溫帶和亞熱帶地區(qū)，這種氣候本身就利于隱球菌生長(zhǎng)與傳播，且中國(guó)人口基數(shù)大，人群流動(dòng)性強(qiáng)，勢(shì)必其將對(duì)公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。研發(fā)新型抗真菌藥物、藥物再利用以及天然物質(zhì)中提取有效成分來(lái)協(xié)同抑菌、殺菌是未來(lái)積極應(yīng)對(duì)威脅的突破口。

在本課題組前期的總結(jié)研究中，許多植物提取化合物能與現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，可以提高其抗真菌活性與敏感性、減少不良反應(yīng)的發(fā)生。粗糠柴苦素從植物中提取[17]，安全、副作用低，最初報(bào)道為PKC及其同工酶、CAM激酶III的天然抑制劑。在前期報(bào)道中，本研究中證實(shí)粗糠柴苦素對(duì)隱球菌本身具有一定的抗真菌作用，然而其單藥MIC50相對(duì)較高，同時(shí)與氟康唑聯(lián)合使用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，使氟康唑的MIC值降低了50%～93.75%，提高氟康唑?qū)﹄[球菌的敏感性。根據(jù)分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)效應(yīng)定義，F(xiàn)ICI數(shù)值越小，說(shuō)明兩種藥物的協(xié)同作用越強(qiáng)[9, 18]，表2可以發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌種屬FICI范圍為0.127～0.50，中位數(shù)為0.348，而格特隱球菌(Cryptococcusgattii)種屬FICI范圍為0.07～0.50，中位數(shù)為0.418，提示兩種藥物對(duì)新生隱球菌種屬的協(xié)同作用較強(qiáng)；臨床株FICI范圍為0.127～0.50，中位數(shù)為0.387，而環(huán)境株FICI范圍為0.25～0.50，中位數(shù)為0.351，提示兩種藥物對(duì)隱球菌環(huán)境株的協(xié)同作用略強(qiáng)于臨床株。

最近研究表明粗糠柴苦素廣泛抑制蛋白激酶，并且最有效地抑制PRAK和MAPKAP-K2通路，導(dǎo)致微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β-II增強(qiáng)，并使S期激酶相關(guān)蛋白2表達(dá)水平下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[21-22]；通過(guò)靶向上游mTORC1控制途徑來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，富集細(xì)胞內(nèi)自噬體，從而激活自噬，細(xì)胞膜對(duì)抗真菌藥的通透性增加；mTORC1還可以導(dǎo)致帽依賴性蛋白質(zhì)翻譯的嚴(yán)重失調(diào)，使eIF4E和由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激負(fù)調(diào)節(jié)的翻譯起始因子eIF2均受到抑制。此外，粗糠柴苦素可以充當(dāng)線粒體氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，使細(xì)胞線粒體完成氧化而不能完成磷酸化，即可以利用氧而不能產(chǎn)生供能的ATP[24]，有可能影響到負(fù)責(zé)藥物外排的蛋白質(zhì)，包括 ABC(ATP-binding cassette)超家族等，減少唑類藥物外排[16]。當(dāng)然還需要進(jìn)一步的機(jī)制實(shí)驗(yàn)來(lái)精確探究粗糠柴苦素抗隱球菌的機(jī)制。

綜上所述，粗糠柴苦素作為多酚類熱點(diǎn)分子化合物，對(duì)隱球菌具有一定的抗真菌活性，與氟康唑聯(lián)合時(shí)，能夠發(fā)揮協(xié)同殺菌作用。粗糠柴苦素來(lái)源于天然植物，具有易獲取、副反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，推測(cè)粗糠柴苦素具有一定的治療隱球菌病的應(yīng)用前景。