申旺 楊文麗 葉麗燕 譚曉宇 黃晨娟 張鑫

(1.暨南大學(xué)附屬五邑中醫(yī)院檢驗科，江門 529000；2.江門市中心醫(yī)院病理科，江門 529030)

【關(guān)健詞】 G試驗；念珠菌；曲霉菌；侵襲；診斷

近年來，隨著現(xiàn)代治療手段的大量開展，廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，腫瘤、血液病、糖尿病等發(fā)病率不斷上升，導(dǎo)致侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)逐年上升，其中又以侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)為主，約占60%～80%[1-2]。IFD診斷的主要方法是組織真菌培養(yǎng)和鏡檢，但其檢測時間長，陽性率低，常延誤患者的診斷和治療，是造成IFD患者高死亡率的原因之一[3]。近年來，(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(G試驗)成為深部真菌病研究的熱點，其在IFD診斷中的價值已得到國內(nèi)、外研究的認可[2-4]。曲霉菌是除念珠菌外，引起IFD的第二大致病菌，但少見G試驗在IC和侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)間的比較研究，同時也缺乏G試驗在不同IC患者中的診斷價值差異性研究。本實驗通過對不同人群G試驗水平的比較，探討其在IC患者診斷中的臨床價值及與患者粒細胞、病原菌、體溫之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年9月至2018年6月期間在暨南大學(xué)附屬五邑中醫(yī)院住院治療的侵襲性念珠菌病(IC)患者55例(同時伴有發(fā)熱≥37.5℃)、侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)患者42例(均為肺部或支氣管曲霉病)，兩組患者均符合《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則(第四次修訂版)》[5]中的深部真菌病確診組和臨床診斷組的診斷指標；同時收集念珠菌黏膜定植組者30例(排除真菌感染，僅痰或中段尿中培養(yǎng)出念珠菌)和健康體檢者50名。以上各組研究對象在性別和年齡上均無統(tǒng)計學(xué)差異，同時排除近期有輸注白蛋白、免疫球蛋白、抗腫瘤的多糖類等藥物及近1個月內(nèi)有過血液透析治療的患者。本研究通過本院倫理委員會批準，入選對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

廈門市鱟試劑實驗廠有限公司生產(chǎn)的(1,3)-β-D-葡聚糖試劑，德國ELx808IU酶標儀，沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基，凱林念珠菌屬真菌顯色培養(yǎng)基，上海躍進SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，法國梅里埃BacT/AlerT3D全自動血培養(yǎng)儀及其配套的血培養(yǎng)瓶，法國梅里埃API-20C AUX酵母菌鑒定板和ATB Expression半自動微生物鑒定儀。

1.3 G試驗操作和真菌培養(yǎng)鑒定

IC 組和IA組患者于使用抗真菌藥物治療前連續(xù)2天抽取2次血液進行 G 試驗檢測,操作過程嚴格按照儀器和試劑說明書進行,反應(yīng)管和吸嘴均去除熱原,若兩次均為陽性,則以第1次結(jié)果為準,若2次結(jié)果不相符,則重新抽取標本,以第3次檢測結(jié)果為準。念珠菌黏膜定植組患者和健康人群于清晨空腹采集靜脈血1次進行G試驗。以G試驗水平≥10 pg/mL為結(jié)果陽性。

在患者使用抗真菌藥物前，采用無菌方法采集患者的可疑感染標本比如血液、膿液、胸腹水、引流液等，接種血培養(yǎng)瓶或血平板，若有細菌生長，涂片鏡檢確認為真菌后，再接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基和真菌顯色培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d，若無菌落生長則為培養(yǎng)陰性；若有翠綠色菌落生長則為白念珠菌；藍灰色則為熱帶念珠菌；粉色為光滑念珠菌；淡粉色和紫色為克柔念珠菌；白色為其他念珠菌，同時結(jié)合API-20C AUX酵母菌鑒定板鑒定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS19.0軟件對資料進行正態(tài)性檢驗，計量單位采用四分位數(shù)M(P25，P75)描述，診斷價值采用受試者工作曲線(ROC)分析，組間比較采用軼和檢驗，率之間的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者的G試驗水平

IC組患者的G試驗濃度為73.56(26.80,157.90) pg/mL，與健康正常組、念珠菌黏膜定植組、IA組感染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 IC患者念珠菌菌種的分布

55例IC患者中，有23例患者培養(yǎng)出白念珠菌，占比為41.82%，低于非白念珠菌58.18%(32/55)。32例非白念珠菌的病原菌包括熱帶念珠菌12例(21.82%)，光滑念珠菌10例(18.18%)，克柔念珠菌4例(7.27%)，近平滑念珠菌3例(5.45%)，季也蒙念珠菌、角膜念珠菌和葡萄牙念珠菌各1例(1.82%)。

2.3 G試驗在IC中的診斷價值

分別以非IFD組(健康正常組和念珠菌定植組)和非IC組(健康正常組、念珠菌定植組和IA組)作為對照組，做G試驗診斷IC組患者的受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)，發(fā)現(xiàn)G試驗在IC患者中均有較高的診斷價值(AUC分別為0.899、0.782)，見表2。

2.4 G試驗在不同IC患者中的陽性率差異分析

以ROC曲線AUC最大的臨界點G試驗19.05 pg/mL為判斷標準，55例IC患者中有43例G試驗為陽性，根據(jù)IC患者的中性粒細胞數(shù)量、體溫高低、病原菌類型進行分組。G試驗在中性粒細胞正常組中陽性率最高為93.10%，與增高組和減少組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與粒細胞缺乏組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；G試驗在白念珠菌感染組中的陽性率最高為86.96%，與熱帶和光滑念珠菌感染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.699)，但顯著高于其他念珠菌感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)；G試驗在中熱組中的陽性率最高為82.86%，但與高熱組和低熱組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表1 各組G試驗濃度分析

表2 G試驗診斷IC患者的ROC分析

表3 G試驗陽性率與IC患者白細胞、體溫、病原菌之間的關(guān)系

3 討 論

念珠菌是一種在自然界廣泛存在并可寄生于人體的最常見真菌。正常條件下，念珠菌只寄生于人體皮膚、口腔、陰道、黏膜等處，不會導(dǎo)致深部真菌感染，當人體免疫功能低下、生理屏障喪失、菌種失調(diào)時，念珠菌可侵入人體組織、器官、血液，導(dǎo)致侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)[6]。由于念珠菌是條件致病菌，IC臨床癥狀缺乏特異性，易被原發(fā)疾病或并發(fā)癥所掩蓋，故極易被誤診、漏診。真菌培養(yǎng)是臨床最常見的IC診斷方法，不僅可明確病原菌，還可為臨床治療提供實驗室依據(jù)，但真菌培養(yǎng)時間長，同時受標本采集不規(guī)范、運送過程或接種時易被污染等影響，尤其無法將致病菌和定植菌、污染菌有效區(qū)分[7]，故會影響臨床醫(yī)生的診斷，從而延誤治療，這也是導(dǎo)致IC患者高死亡率的原因之一。

(1,3)-β-D-葡聚糖是一種多糖，存在于除隱球菌和接合菌外的所有真菌細胞壁中，當念珠菌侵入人體組織或血液時，可被粒細胞和巨噬細胞吞噬或消化，從而破壞其細胞壁，使(1,3)-β-D-葡聚糖大量釋放到血液或體液中，導(dǎo)致(1,3)-β-D-葡聚糖水平升高。當念珠菌定植時，機體未發(fā)生炎癥反應(yīng)，念珠菌不會被吞噬，故(1,3)-β-D-葡聚糖也不會釋放出來。因(1,3)-β-D-葡聚糖能與馬蹄蟹中的一種G凝血因子結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，可根據(jù)其濁度的變化程度進行定量檢測，故(1,3)-β-D-葡聚糖檢測又稱為G試驗[8]。

本研究中，IC組患者的G試驗濃度顯著高于健康正常組和念珠菌黏膜定植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明G試驗不僅能判斷IC感染的發(fā)生，還能有效區(qū)分其為致病菌還是定植菌。研究也發(fā)現(xiàn)IC組G試驗濃度顯著高于IA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這表明G試驗可能對致病真菌是念珠菌還是曲霉菌也有一定的鑒別價值，這可能一方面與念珠菌細胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖含量比曲霉菌更高有關(guān)，另一方面也與研究診斷標準的差異性有關(guān)，本研究以在患者支氣管肺泡灌洗液中鏡檢有尖銳分支的、分隔的菌絲即為IA的微生物學(xué)標準。

以往認為白念珠菌是IC感染的主要致病菌，但在本研究的55例IC患者中，非白念珠菌感染患者32例，多于白念珠菌的23例，其中非白念珠菌又以熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主(40.00%)，其次為克柔念珠菌和近平滑念珠菌(12.73%)，與秦曉峰等[9]研究略有不符，但和中國侵襲性真菌檢測網(wǎng)CHIF-NET的數(shù)據(jù)[10]基本一致。這表明非白念珠菌已超越白念珠菌成為院內(nèi)念珠菌感染的主要菌種，這可能與唑類抗真菌藥物的大量使用有關(guān)[11]。臨床醫(yī)生常用唑類抗真菌藥物預(yù)防真菌感染的發(fā)生，白念珠菌對唑類抗真菌藥物有較高的敏感性，克柔念珠菌和近平滑念珠菌也比較敏感，但光滑念珠菌和熱帶念珠菌對唑類藥相對耐藥。

本研究分別以健康正常組、念珠菌黏膜定植組和以健康正常組、念珠菌黏膜定植組、IA組作為對照，采用ROC曲線分析G試驗在IC患者中的診斷價值，發(fā)現(xiàn)G試驗不僅對IC具有較高的診斷價值(AUC分別為0.899,0.782)，還能有效區(qū)分IC和IA感染。這可能與兩者感染部位有關(guān)，IC常以念珠血癥和播散性念珠菌病為主，易侵入血液，而IA主要感染患者的支氣管-肺組織。支氣管和肺組織內(nèi)含有大量氣道黏膜分泌的糖蛋白、脂質(zhì)、蛋白聚糖等成分，一方面可將曲霉包裹起來防止被吞噬細胞吞噬或消化；另一方面即使被巨噬細胞清除，其釋放的(1,3)-β-D-葡聚糖也往往局限于呼吸道，較少出現(xiàn)在血中，只有當曲霉生長并伴血管侵犯時，才會釋放入血[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)G試驗在IC中的陽性率與患者中性粒細胞含量和念珠菌的種類有關(guān)，與體溫無關(guān)。G試驗在中性粒細胞正常組的陽性率最高(93.10%)，與中性粒細胞增高組和減少組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但顯著高于中性粒細胞缺乏組(28.57%)，這提醒對于粒細胞缺乏的患者，G試驗可能存在較高的假陰性。粒細胞缺乏常見于腫瘤放化療、骨髓抑制、免疫缺陷等患者，同時這些也是念珠菌感染的高危因素，但粒細胞缺乏同時可造成免疫應(yīng)答減弱，導(dǎo)致被粒細胞和巨噬細胞吞噬的念珠菌減少，釋放的(1,3)-β-D-葡聚糖也相應(yīng)降低，使得患者G試驗濃度未達到陽性臨界線[13]。本研究中的2例粒細胞缺乏G試驗陽性的IC患者均是腫瘤連續(xù)化療后導(dǎo)致的，未存在吞噬細胞功能缺陷，其病原菌也均是白念珠菌。本研究也從病原菌角度對G試驗陽性率進行了分析，發(fā)現(xiàn)白念珠菌IC組患者的G實驗陽性率高于其他兩組，這可能與白念珠菌定植分布廣泛以及其獨特的入侵機制有關(guān)，一方面白念珠菌被吞噬細胞吞噬后，仍能繁殖如生成芽管并長出菌絲，另一方面在包括樹突細胞、粒細胞在內(nèi)的所有髓系細胞和上皮細胞、肥大細胞等B細胞中均有C型凝集素受體(Dectin-1)的表達，Dectin-1受體的主要作用是識別白念珠菌的(1,3)-β-D-葡聚糖[14]，從而充分激活宿主細胞對白念珠菌的免疫應(yīng)答，使白念珠菌大量被吞噬消化，促使(1,3)-β-D-葡聚糖釋放。有文獻[15]指出G試驗在近平滑念珠菌深部感染時陽性率偏低，由于本實驗中近平滑念珠菌例數(shù)較少，未對其進行單獨分析，以后將多收集標本例數(shù)，進一步研究證實。發(fā)熱是人體對病原菌入侵產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)從而產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象，理論上體溫升高可加快免疫應(yīng)答反應(yīng)，如加速白細胞的增殖和運動，增強巨噬細胞吞噬病原菌的能力等等。但本研究發(fā)現(xiàn)G試驗陽性率與IC患者體溫相差不大，這可能與發(fā)熱患者使用抗生素等降溫藥有關(guān)，需要進一步研究。

綜上所述，G試驗對IC具有較高的診斷價值，不僅能有效區(qū)分致病菌和定植菌，還對念珠菌感染和曲霉菌感染有一定的鑒別作用。G試驗的陽性率與IC患者的體溫無關(guān)，與中性粒細胞數(shù)量和病原菌類型存在一定的關(guān)系，尤其在粒細胞缺乏IC患者和除白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌外的其他念珠菌感染的IC患者中的陽性率偏低。