陳文煒，高星健，張華，陳沁，江濤，高銳，毛厚平

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，福建 福州 350005)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)RCC病例約295 000 例，20%～30%的RCC患者在診斷和腎切除術(shù)時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，5年生存率不足10%[1]。因此，深入研究RCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制具有重要的臨床意義。Ras超家族由Rap家族與Ras共同組成，可參與細胞增殖、周期、分化等多種生物學(xué)過程，Rap家族共有5個成員，分別為Rap1a、Rap1b、Rap2a、Rap2b和Rap2c，Rap2a在多種類型腫瘤中表達顯著上調(diào)[2- 3]。在RCC中，Rap2a可通過激活p- Akt途徑參與腎癌發(fā)展惡化[4]。MicroRNA(miR)是一種長約18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可作為原癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR- 135a與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其可通過靶向調(diào)節(jié)骨髓細胞瘤病毒癌基因(cellular- myelocytomatosis viral oncogene，c- Myc)表達來抑制RCC細胞增殖[6]。然而，miR- 135a對RCC侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究報道較少。本研究利用Target Scan軟件預(yù)測出與Rap2a的3′UTR互補結(jié)合的miRNA—miR- 135a，并進一步揭示miR- 135a對RCC細胞遷移侵襲的影響及潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

293T細胞、正常腎組織細胞HK- 2及RCC細胞Ketr- 3、786- O、ACHN購自上海艾睿生物科技有限公司，293T、HK- 2、Ketr- 3、ACHN用含10%FBS(Hyclone,美國)+DMEM(Hyclone，美國)、786- O用RPMI 1640(Hyclone，美國)置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

MiR- 135a和陰性對照模擬物購自Gene Pharma(中國上海)公司。用PCR擴增Rap2a的編碼序列并克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒(Addgene，美國)中，構(gòu)建外源過表達Rap2a質(zhì)粒。用PCR擴增Rap2a的3′UTR片段并克隆至pmirGLO質(zhì)粒(Promega，美國)，構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒(Rap2a- WT)，用TakaRa點突變試劑盒將野生型質(zhì)粒上miR- 135a結(jié)合位點進行突變，構(gòu)建突變型報告質(zhì)粒(Rap2a- Mut)。參照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法實驗

收集細胞，用含PMSF裂解液提取蛋白，于4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，用BCA法測蛋白濃度。SDS- PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，切膜并用一抗稀釋液孵育，于4 ℃過夜，二抗稀釋液常溫2 h，曝光顯影?？贵w：Rap2a(1∶1 000,CST，美國)、Akt(1∶1 000,CST,美國)、p- Akt(1∶1 000,CST,美國)。β- actin(1∶1 000,CST,美國)作為內(nèi)參。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗

將pmirGLO- Rap2a- WT、pmirGLO- Rap2a- Mut質(zhì)粒與miR- 135a或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)至293T細胞，48 h 后用雙熒光素酶活性試劑盒(Promega，美國)檢測熒光素酶活性變化。

1.5 細胞侵襲遷移檢測

侵襲小室分兩種，一種無預(yù)鋪膠用于細胞遷移實驗，另一種有預(yù)鋪膠用于細胞侵襲實驗。將200 μl含5× 104個細胞的培養(yǎng)液接種至上室中，下室中加入500 μl完全培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，孵育48 h后用棉簽將上室中殘留物擦掉，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗3次，4%多聚甲醇固定10 min，晾干后結(jié)晶紫染色10 min，雙蒸水洗3次于鏡下觀察，每個小室隨機選擇3個視野進行細胞計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Rap2a在RCC細胞系中高表達

見圖1。Rap2a在RCC細胞系Ketr- 3、786- O和ACHN中的表達明顯高于正常腎組織細胞HK- 2(P<0.05)，其中Ketr- 3中Rap2a表達相對最高，故后續(xù)實驗選取Ketr- 3作為研究對象。

圖1Rap2a在腎細胞HK-2和RCC細胞786-O、ACHN、Ketr-3中的表達

2.2 Rap2a是miR- 135a的靶基因

Target Scan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Rap2a是miR- 135a的靶基因，Rap2a的3′UTR中含有與miR- 135a種子區(qū)反向互補的核苷酸序列(圖2A)。將野生型Rap2a- WT和突變型Rap2a- Mut報告質(zhì)粒與miR- 135a或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)染入293T細胞，孵育48 h后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，過表達miR- 135a可顯著下調(diào)Rap2a- WT的熒光素酶活性，而對Rap2a- Mut的熒光素酶活性無明顯影響(圖2B)，表明Rap2a是miR- 135a的靶基因。

A.miR- 135a與Rap2a的3′UTR結(jié)合位點示意圖；B.報告質(zhì)粒pmirGLO聯(lián)合miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染入293T細胞后熒光素酶活性變化；與陰性對照組比較，aP<0.05

圖2miR-135a與Rap2a的3′UTR結(jié)合位點示意圖及對轉(zhuǎn)染Rap2a報告質(zhì)粒的293T細胞熒光素酶活性的影響

2.3 miR- 135a可抑制Rap2a及其下游信號通路

見圖3、表1。與陰性對照組相比，過表達miR- 135a后Ketr- 3細胞中Rap2a及其下游蛋白p- Akt表達顯著下調(diào)；而miR- 135a和Rap2a共表達后Ketr- 3細胞中Rap2a及其下游p- Akt表達恢復(fù)(P<0.05)。

圖3Ketr-3細胞中Rap2a、p-Akt、Akt蛋白電泳圖

組 別蛋白相對表達水平Rap2ap-AktAkt陰性對照組0.81±0.030.96±0.100.51±0.02miR-135a組0.17±0.06a0.38±0.04a0.63±0.08miR-135a+Rap2a組0.79±0.13b0.73±0.09b0.58±0.01

與陰性對照組比較，aP<0.05；與miR- 135a組比較，bP<0.05

2.4 miR- 135a靶向Rap2a對細胞遷移侵襲影響

Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，過表達miR- 135a可顯著抑制Ketr- 3細胞的遷移侵襲能力，而miR- 135a和Rap2a共表達后Ketr- 3細胞遷移侵襲能力恢復(fù)(P<0.05)(圖4A、B)。

A.miR- 135a對細胞遷移的影響；B.miR- 135a對細胞侵襲的影響;與陰性對照組比較，aP<0.05；與miR- 135a組比較，bP<0.05

圖4miR-135a對細胞遷移侵襲能力影響

3 討 論

RCC是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，放、化療及生物免疫治療均不敏感，手術(shù)是目前主要的治療手段，但有20%～30%的患者在就診之初已發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴重影響預(yù)后[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜生物學(xué)過程，其中細胞遷移侵襲是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[8]。因此，針對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的干預(yù)是腫瘤治療的切入點之一。

Rap2a是Rap GTP結(jié)合蛋白家族的成員之一，屬Ras超家族，其可調(diào)控細胞的多種生物學(xué)進程，如細胞黏附、分化和增殖等[9]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Rap2a與腫瘤的形成及惡化有關(guān)。有研究報道，Rap2a的下游效應(yīng)因子Rap2相互作用蛋白9(Rap2 interacting protein 9,RPIP9)在乳腺癌中的表達增高，且與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)，其另一下游效應(yīng)因子絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4(mitogen- activated protein kinase kinase kinase kinase4, MAP4K4)在多種腫瘤組織中均高表達，且與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[10- 11]。Prabakaran等[12]發(fā)現(xiàn)，Rap2a在從濾泡型甲狀腺癌組織中分離的具有高侵襲能力的癌細胞中高表達,且與甲狀腺癌浸潤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。上述研究表明，Rap2a在多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤細胞遷移侵襲密切相關(guān)。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，Rap2a在正常腎組織細胞中低表達，而在RCC細胞中高表達，這與先前文獻研究[4]結(jié)果相一致。然而，其在RCC細胞中高表達的機制仍未完全闡明，推測表觀遺傳的改變可能是導(dǎo)致其高表達的原因之一。

MicroRNA是表觀遺傳學(xué)中的研究熱點之一，其在調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)編碼基因表達能力方面是獨一無二的，一個miRNA能夠靶向調(diào)控許多基因，全面參與調(diào)控多種生物過程[13]。MiR- 135a作為一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子RNA，在多種腫瘤中呈低表達。Dang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 135a在胰腺癌組織中的表達較癌旁組織顯著下調(diào)，并可通過靶向抑制B細胞 特異的莫洛尼鼠白血病毒插入位點1基因(B cell- specific Moloney murine leukemia virus integration site 1, Bmi1)的表達進而抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲。Hidaka等[15]在研究腎癌miRNA表達譜中也發(fā)現(xiàn)miR- 135a顯著低表達。此外，Yamada等[6]發(fā)現(xiàn)，miR- 135a作為抑癌因子可通過靶向抑制c- Myc表達來抑制腎癌細胞增殖。上述研究表明，miR- 135a在多種惡性腫瘤中低表達，且過表達miR- 135a可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移侵襲能力。本研究通過TargetScan軟件預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測和蛋白質(zhì)印跡法實驗證實，Rap2a是miR- 135a的靶基因，并且在RCC細胞Ketr- 3中，過表達miR- 135a可通過靶向抑制Rap2a/p- Akt信號進而抑制細胞遷移侵襲能力，miR- 135a在RCC中亦同樣發(fā)揮抑癌基因功能。

綜上所述，本研究證實，miR- 135a作為腫瘤抑制因子，可通過靶向調(diào)控Rap2a抑制RCC細胞的遷移和侵襲，并下調(diào)Akt信號通路的活化。本研究從表觀遺傳學(xué)角度闡釋Rap2a在RCC中高表達的可能機制，為深入了解RCC惡化轉(zhuǎn)移機制提供了新見解，同時也為RCC的臨床治療提供了新靶點。