史 蓉，周 麗，段 亭，王 蓉

(酒泉市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅酒泉735000)

枸杞(Lycium barbarum)是茄目茄科枸杞屬植物，屬衛(wèi)生部公布的藥食同源品種，《本草綱目》記載:“枸杞，補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝，明目，堅(jiān)精骨，去疲勞，易顏色，變白，明目安神，令人長(zhǎng)壽”［1］，在我國(guó)的食品、保健品和醫(yī)藥業(yè)方面占據(jù)了重要地位。GB/T 18672－2014《枸杞》［2］將枸杞分為四個(gè)等級(jí):特優(yōu)、特級(jí)、甲級(jí)、乙級(jí);枸杞的外觀品質(zhì)主要有:形狀、雜質(zhì)、色澤、滋氣味、不完善粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)、無使用價(jià)值粒、粒度、百粒重，這些決定著枸杞的商品特性;蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素、甜菜堿等決定著枸杞的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值。

目前，盡管許多人工合成的抗氧化性物質(zhì)如丁基對(duì)苯酚(BHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)等可以抑制氧自由基反應(yīng)的發(fā)生，但基于安全性方面的考慮，合成抗氧化劑的使用越來越多的受到限制，因而，近年來，從天然植物中尋找高安全性的天然抗氧化物質(zhì)引起人們廣泛關(guān)注［3］。有研究得出，甜菜堿是枸杞中的主要藥效成分之一，具有良好的穩(wěn)定性及抗氧化性［4］，但目前還未見將枸杞提取液直接作用于易氧化的動(dòng)物油脂，直接反映其抗氧化作用的報(bào)道。枸杞多糖對(duì)細(xì)菌、霉菌有一定的抑制效果［5］，但細(xì)菌性食物中毒的患者一般都表現(xiàn)有明顯的胃腸炎癥狀，評(píng)價(jià)枸杞提取液對(duì)常見腸道致病菌的抑菌效果更有意義。

因此本實(shí)驗(yàn)以酒泉枸杞為研究對(duì)象，對(duì)提取液中的枸杞多糖、甜菜堿、總酚這3種功能性成分進(jìn)行測(cè)定，分別用兩種方法測(cè)定提取液抑菌性和抗氧化性，以期對(duì)枸杞的深加工和功能性開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級(jí)枸杞 產(chǎn)地酒泉;豬油 市售;金黃色葡萄球(Staphylococcus aureus)ATCC25923、銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)ATCC27853、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC25922、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028 廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心;營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京陸橋;抗壞血酸、沒食子酸、葡萄糖 甜菜堿 分析純，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;蒽酮、無水乙醇、碳酸氫鈉、草酸、鐵氰化鉀均為分析純 天津市百世化工有限公司;福林酚(Folin－Phenol) 阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司;圓濾紙片(直徑10 mm，厚度1.5 mm) 新華濾紙。

LDZX－75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX－250培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;BHC－1300ⅡA2型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PL602E電子天平、FE20型pH計(jì) 梅特勒托利多儀器有限公司;SP－756P紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;CS－9000薄層掃描儀 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞提取液的制備 參考GB/T 18672－2014《枸杞》附錄A［6］，取枸杞樣品于80℃干燥6 h，粉碎均勻，分別準(zhǔn)確稱取 2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 g 樣品，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇溶液80℃水浴回流提取1 h，趁熱過濾。殘?jiān)脽崴粗猎浚铀?00 mL，沸水浴回流提取2 h，提取其中所含的有效成分，趁熱過濾，洗液并入濾液，冷卻后移入200 mL容量瓶中定容，制成1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的提取液。

測(cè)定枸杞提取液中枸杞多糖、總酚、甜菜堿3種有效成分的含量，因稱樣量高于國(guó)標(biāo)，為避免吸光度過高不能讀數(shù)，選取1.0%的提取液為測(cè)定樣。

1.2.2 枸杞多糖的測(cè)定 參考GB/T 18672－2014《枸杞》附錄A［6］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，枸杞多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.00573x+0.01402(R2≥0.99)。取1.0%的樣液1 mL加純水和苯酚液各1 mL，滴加硫酸5 mL，振蕩混勻，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定吸取的待測(cè)液中葡萄糖的質(zhì)量(μg/mL)，按公式1計(jì)算枸杞中的枸杞多糖含量。

其中:W1為枸杞多糖含量(%)，3.19為葡萄糖換算多糖換算因子，A為提取液中葡萄糖濃度(μg/mL)。

1.2.3 總酚的測(cè)定 使用Folin－Ciocalteu法進(jìn)行測(cè)定［7－8］，樣品總酚含量%以沒食子酸來表示。取1.0%的樣液1 mL加10%福林酚5 mL，7.5%的Na2CO3溶液4 mL，搖勻，室溫下放置60 min，765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。取1 mg/mL沒食子酸溶液稀釋成0.1 mg/mL，再 稀 釋 成 0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 mg/mL，同一條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0093x+0.0319(R2≥0.99)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定吸取的待測(cè)液中沒食子酸的質(zhì)量(μg/mL)。按公式(2)計(jì)算樣品總酚含量。

其中:W2為枸杞總酚含量(%)，A為提取液中沒食子酸濃度(μg/mL)。

1.2.4 甜菜堿的測(cè)定 采用《中國(guó)藥典》［1］中枸杞子甜菜堿的測(cè)定，薄層色譜法。

1.2.5 枸杞提取液抑菌效果的測(cè)定

1.2.5.1 菌懸液的制備 選取4種腸道致病菌:金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌的二代斜面培養(yǎng)物，無菌條件下分別挑取適量菌苔，用無菌水稀釋制成102～105CFU/mL之間的菌懸液。

1.2.5.2 圓濾紙片法 圓濾紙片分別放入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的4個(gè)不同濃度的枸杞提取液中，121℃滅菌15 min。分別將金黃色葡萄球菌、銅綠假單菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌菌懸液吸取0.1 mL，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，用無菌鑷子將濾紙片貼于含菌平板上，每個(gè)平板均勻貼4張不同濃度的濾紙片。操作完成后平板置于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，取出測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5.3 菌落計(jì)數(shù)法 營(yíng)養(yǎng)瓊脂的配制方法為3.3 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉，加100 mL純水溶解，用2.5%、5.0%、7.5%、10.0%，的枸杞提取液代替純水配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂，121℃高壓滅菌15 min，備用。吸取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌菌懸液各1 mL于無菌平皿中，傾注4個(gè)不同濃度的枸杞提取液配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15～20 mL，平板置于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)(CFU/mL)，純水配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂為空白對(duì)照，抑菌率用公式3計(jì)算。

式中:n1:純水營(yíng)養(yǎng)瓊脂中菌落數(shù);n2:不同濃度枸杞提取液瓊脂中菌落數(shù)。

1.2.6 枸杞提取液抗氧化效果的測(cè)定

1.2.6.1 枸杞提取液對(duì)豬油的抗氧化作用 取25 g豬油于40 mL燒杯，分別加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的枸杞提取液10 mL，混合均勻覆蓋封口膜，設(shè)置空白對(duì)照，0.1%BHA為陽性對(duì)照。油樣于40℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)存放，每24 h攪拌一次，每隔3 d準(zhǔn)確稱取2～3 g豬油于錐形瓶中，按GB5009.227－2016食品中過氧化值的測(cè)定中第一法滴定法［9］測(cè)定其過氧化值，連續(xù)測(cè)定24 d。

1.2.6.2 枸杞提取液還原能力的測(cè)定 參考Liu等［10］的方法稍作修改。10 mL的離心管中分別加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和不同濃度(1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%)的枸杞提取液1 mL，加入2.5 mL1%鐵氰化鉀，混勻，50℃反應(yīng)20 min，取出加2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，5000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.3%三氯化鐵，混勻靜置10 min，在700 nm處檢測(cè)吸光值，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。以蒸餾水為空白，以0.1%～0.5%的VC為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果表示為珋x±s，數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞提取液中有效成分分析

枸杞經(jīng)過乙醇回流除去雜質(zhì)，熱水回流提取，經(jīng)過計(jì)算得出枸杞中3種有效成分含量如表1所示。

表1 枸杞中3種有效成分含量(g/100 g)Table 1 Contents of three activeingredients in wolfberry(g/100 g)

不同地區(qū)的枸杞中有效成分含量會(huì)有所不同，艾百拉·熱合曼等［11］的研究結(jié)果顯示，自然晾曬干燥的民勤枸杞多糖含量為(1.586±0.16)g/100 g，甜菜堿含量為(1.636±0.20)g/100 g，總酚含量為0.077 g/100 g。本實(shí)驗(yàn)得出酒泉枸杞多糖含量為(6.44±0.22) g/100 g，甜菜堿含量為(1.21±0.16)g/100 g，總酚含量為(0.12 ±0.03)g/100 g。相比兩個(gè)地區(qū)的枸杞，在甜菜堿和總酚含量方面相差不大，但本實(shí)驗(yàn)得出枸杞多糖含量較高，可能和酒泉地區(qū)晝夜溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。

2.2 枸杞提取液抑菌能力分析

2.2.1 圓濾紙片法測(cè)定枸杞提取液抑菌效果 本文所選的4種供試菌是食品中常見的腸道致病菌，因此以這4種菌作為測(cè)試對(duì)象具有一定代表性，由表2可以看出，枸杞提取液對(duì)這4種腸道致病都有一定的抑制效果，隨著提取液濃度的增加，抑菌圈直徑變大。抑菌效果:鼠傷寒沙門氏菌＞銅綠假單胞菌＞大腸埃希氏菌＞金黃色葡萄球菌。枸杞提取液濃度≥2.5%，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌都有抑制作用，枸杞提取液濃度≥5.0%，開始對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。高春燕等［5］得出，對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，枸杞多糖對(duì)它們的抑制作用相當(dāng)，無顯著差異，在10 mg/mL時(shí)有抑菌圈，且大約都是10 mm。在本實(shí)驗(yàn)中枸杞提取液含量為10.0%時(shí)，枸杞多糖含量為0.6 mg/mL，大腸埃希氏菌的抑菌圈為(3.9±0.1)mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈為(1.8±0.2)mm，抑菌能力比單一枸杞多糖強(qiáng)，說明枸杞提取液中其它成分也有抑菌性。

表2 圓濾紙片法測(cè)定抑菌效果Table 2 Determination of bacteriostasis effect by circular filter paper method

2.2.2 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定枸杞提取液抑菌效果 從表3可以看出，隨著營(yíng)養(yǎng)瓊脂中枸杞提取液濃度的增加，對(duì)這4種致病菌的抑制作用越明顯，枸杞提取液含量為2.5%時(shí)，對(duì)大腸埃希氏菌的抑制率超過50%，枸杞提取液含量為5.0%時(shí)，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制率超過50%。

表3 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定抑菌率Table 3 Determination of bacteriostasis rate by colony counting method

通過以上兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，不同濃度的枸杞提取液對(duì)這4種致病菌都有抑制作用，分析抗菌機(jī)制有兩種可能，一是枸杞提取液中大量的低聚糖類，作用于菌體后，迅速破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物正常穿過細(xì)胞膜，使微生物失去營(yíng)養(yǎng)而致其生長(zhǎng)停滯，達(dá)到抑菌的目的［12］。二是枸杞提取液中少量的甜菜堿和多酚類物質(zhì)凝固細(xì)菌蛋白，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與細(xì)菌遺產(chǎn)物質(zhì)DNA結(jié)合，從而改變細(xì)菌生理，抑制生長(zhǎng)［13］。枸杞提取液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌這3種革蘭氏陰性菌的抑制作用較強(qiáng)，圓濾紙片法得出其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，菌落計(jì)數(shù)法得出其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)。可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層次較少，交聯(lián)程度較低，所以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，較易被破壞，革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸，其肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比革蘭氏陰性菌致密［12］。圓濾紙片法每片濾紙片枸杞提取液含量少，對(duì)細(xì)胞壁破壞能力弱，菌落計(jì)數(shù)法用枸杞提取液配制培養(yǎng)基，每mL有效物質(zhì)含量高，對(duì)細(xì)胞壁破壞作用較強(qiáng)。

2.3 枸杞提取液抗氧化能力分析

2.3.1 不同濃度枸杞提取液對(duì)豬油的抗氧化作用 由圖1可知，經(jīng)過一段時(shí)間氧化，添加枸杞提取液和BHA的豬油POV值明顯低于空白對(duì)照的POV值，提取液添加量為5%時(shí)，與添加0.1%BHA的POV值無顯著性差異(p＞0.05)，枸杞提取液添加量為7.5%時(shí)，POV值略低于BHA，說明枸杞提取液具有抑制油脂氧化的作用。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，添加了枸杞提取液的豬油POV值也在增大，但總體低于空白對(duì)照。同一時(shí)間段，枸杞提取液濃度越大，POV值越低。由此可見，枸杞提取液具有一定的抗氧化作用。

圖1 枸杞提取液對(duì)豬油POV值的影響Fig.1 Effect of wolfberry extracts on POV value of lard

2.3.2 枸杞提取液的還原能力 還原能力是反映物質(zhì)抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)，還原能力與抗氧化活性呈正相關(guān)，還原能力越大，抗氧化活性越高［14］。由圖2可知，隨著枸杞提取液含量的增加，吸光度逐漸增加，但比VC的還原能力要弱，1.0 mg/mL的枸杞提取液在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.2760，5.0 mg/mL的吸光度為0.5848，10.0 mg/mL的吸光度為0.8949，均低于0.1 mg/mL的VC的吸光度1.0327，但比靈芝多糖的還原性要強(qiáng)，當(dāng)靈芝多糖濃度為5.0 mg/mL時(shí)，其在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度僅為0.23［15］，說明枸杞提取液有良好的還原能力。這可能是因?yàn)殍坭教崛∫褐泻械目偡?、甜菜堿、枸杞多糖等有效成分具有抗氧化效果。李子果皮、果肉總酚都具有一定的抗氧化活性［16］，甜菜堿能有效維持逆境下蛋白質(zhì)和生物膜的結(jié)構(gòu)和功能［17－18］，多糖抗衰老與其增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除和抗氧化能力有關(guān)［19］。

圖2 枸杞提取液的還原能力Fig.2 Reducing power of wolfberry extracts

圖3 VC對(duì)照品的還原能力Fig.3 Reducing power of VC control

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞提取液具有較強(qiáng)的抑菌能力和抗氧化活性，有機(jī)溶劑回流去除雜質(zhì)，熱水浸提其有效成分，檢測(cè)得出枸杞提取液中枸杞多糖(6.44±0.22)g/100 g、甜菜堿(1.21±0.16)g/100 g含量較高，總酚(0.12±0.03)g/100 g含量較低。枸杞提取液對(duì)3種革蘭氏陰性菌:鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌抑制作用較弱，抑菌能力隨著枸杞提取液濃度的提高而增強(qiáng)。豬油中添加枸杞提取液添加量為5.0%時(shí)，與添加0.1%BHA的POV值無顯著性差異，枸杞提取液添加量為7.5%時(shí)，POV值略低于BHA的，枸杞提取物含量為5.0 mg/mL時(shí)，其在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.5848，高于同濃度靈芝多糖的吸光度，說明枸杞提取液有良好的抗氧化能力。提取液的抑菌和抗氧化作用與其活性成分含量有一定的相關(guān)性。本研究針對(duì)枸杞有效成分提取和抑菌、抗氧化效果，為深入研究其抗菌保鮮方法提供了依據(jù)。