孫時光，左 勇，*，張 晶，黃丹丹，張 鑫，秦世蓉，何頌捷

(1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000;2.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，四川南充637000)

桑椹果酒是以桑椹為原料經(jīng)酵母菌發(fā)酵釀制而成的一種具有較高營養(yǎng)價值的低酒精度飲料，桑椹果酒具有補血、強身、益肝、補腎、明目等功效，為果酒中的極品［1－2］。高級醇是指3個碳原子以上的一元醇類，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇和苯乙醇等［3］。研究表明，高級醇是桑椹果酒中重要的風味物質(zhì)，適量的高級醇可以賦予桑椹果酒特殊的風味和香氣，若桑椹果酒中高級醇含量過少則酒體風味淡薄，若高級醇含量過高則會給桑椹果酒帶來異味，并容易讓飲酒者感到頭疼和醉酒，因此需控制好桑椹果酒中高級醇的含量［4］。

目前，果酒釀造的酵母多數(shù)采用葡萄酒釀酒酵母，由于葡萄汁與桑椹果汁成分有明顯的差異，以葡萄酒釀酒酵母釀造出的桑椹果酒在香氣、味道、口感和色澤方面均有缺陷［5］。因此，采用適合釀造桑椹果酒的專用酵母進行桑椹果酒的釀造，是解決這一問題的關(guān)鍵。本研究擬從桑椹自然發(fā)酵液中分離篩選適合桑椹果酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母，用于桑椹果酒純種發(fā)酵，從而提高桑椹果酒品質(zhì)和降低桑椹果酒中高級醇的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 自然發(fā)酵的桑椹發(fā)酵液;法國諾盟葡萄酒酵母 購于日照隆堡商貿(mào)有限公司;安琪葡萄酒酵母 購于湖北安琪酵母股份有限公司;白砂糖 市售一級白砂糖;YPD富集培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L;YPD固體培養(yǎng)基與斜面保藏培養(yǎng)基:在YPD富集培養(yǎng)基基礎上加入瓊脂20 g/L，滅菌后倒入培養(yǎng)皿或試管;桑椹汁培養(yǎng)基:解凍后現(xiàn)榨的桑椹汁，用白砂糖調(diào)整糖度至21 Brix;正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙醇、乙酸丁酯 成都科隆化學品有限公司;酵母基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

JYZ－E25九陽原汁機 九陽股份有限公司;PH100－2A41L－EP生物顯微鏡 鳳凰光學股份有限公司;SKY－2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海蘇坤實業(yè)有限公司;YXQ－LS－75SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司;Agilent 6890N－5975B氣相色譜儀 美國Agilent公司;TG－16醫(yī)用離心機 四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離 選擇成熟健康無霉變桑椹果破碎打漿，放入三角瓶中于25℃自然發(fā)酵，待三角瓶中有大量氣泡產(chǎn)生時，將一定量發(fā)酵醪接入YPD富集培養(yǎng)基，25℃恒溫振蕩培養(yǎng)2～3 d。將富集好的菌懸液用無菌的YPD固體培養(yǎng)基平板涂布分離，25℃培養(yǎng)2 d。從培養(yǎng)好的平板上選取有典型酵母形態(tài)的單菌落，在YPD培養(yǎng)基平板上進行劃線分離純化并鏡檢，將所得單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基于4℃保存并進行編號命名。

1.2.2 酵母菌的篩選 酵母菌的初篩:將活化好的酵母以5%的接種量接種到無菌桑椹汁培養(yǎng)基中，采用杜氏管發(fā)酵法［6］觀察各菌株的產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量，并比較各菌株的發(fā)酵氣味。

酵母菌的復篩:將初篩所得發(fā)酵力強且氣味較好的菌株活化后按5%的接種量接種于桑椹汁培養(yǎng)基中，25℃無氧發(fā)酵7 d。測定發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)，并對其進行粗略的感官品評。

酵母菌的三級篩選:酵母菌耐乙醇能力的篩選:采用杜氏管發(fā)酵法，調(diào)整桑椹汁培養(yǎng)基中乙醇含量為8%、10%、12%、14%，接種量為5%，25℃發(fā)酵48 h，觀察杜氏管中起泡情況;酵母菌耐SO2能力的篩選:采用杜氏管發(fā)酵法，調(diào)整桑椹汁培養(yǎng)基SO2濃度為60、80、100、120 mg/L，接種量為5%，25 ℃發(fā)酵48 h，觀察杜氏管中起泡情況。

1.2.3 菌株發(fā)酵力的對比分析 將表現(xiàn)良好的菌株與法國諾盟葡萄酒酵母和安琪葡萄酒酵母做對比，按照5%的接種量分別接種于桑椹汁培養(yǎng)基中，25℃恒溫無氧條件下發(fā)酵7 d。檢測發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液乙醇、殘?zhí)?、總酸和揮發(fā)酸含量，并對酒體的色澤和氣味做出感官評價［7］。

1.2.4 高級醇含量的對比 各菌株發(fā)酵結(jié)束后，進行高級醇檢測，對比主要高級醇的含量與總高級醇的含量。

取內(nèi)標乙酸正丁酯標準溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，取待測酒樣進行定容，混勻后過濾膜除雜質(zhì)，取1.5 mL處理后的酒樣加入到自動進樣瓶中，上機。根據(jù)保留時間定性，峰面積內(nèi)標法進行定量。

1.2.5 菌株的鑒定 取斜面保藏的菌株，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min(12000 r/min，4℃)，棄上清液，得到適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用酵母ITS區(qū)通用引物對正向引物ITS1、反向引物ITS4擴增基因組DNA，反應條件為:94℃預變性5 min后進入以下循環(huán):94℃變性45 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 60 s，35 個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產(chǎn)物送往測序公司測序［8］。測序所得結(jié)果上傳到美國國家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中，使用局部比對搜索工具(basic local alignmentsearch tool，BLAST)比對，下載同源性高的基因序列。將所有序列導入MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［9］。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇體積分數(shù)的測定 采用分光光度計法［10］測定發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù)。

1.3.2 還原糖、總酸和揮發(fā)酸含量的測定 參照GB/T 15038－2006 葡萄酒、果酒通用分析方法［11］測定發(fā)酵液中還原糖、總酸和揮發(fā)酸含量。

1.3.3 感官品評 采用左勇［12］等制定的感官評分標準(表1)，組織經(jīng)過感官品評培訓的專業(yè)人員對每批桑椹果酒進行感官品評，結(jié)果取平均值。

1.3.4 氣相色譜法測定高級醇 色譜條件:毛細管柱J＆W 122－7062 DB－WAX 60.0 m ×0.25 mm ×0.25 μm;進樣口溫度230℃，起始溫度45℃，保留2 min，以4℃/min升至120℃，保留2 min，以10℃/min升至230℃，保留3 min;載氣He，檢測器溫度230℃，恒流 1.0 mL/min;進樣量:2 μL［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗設3次平行，試驗結(jié)果均以珋x±sd表示，應用SPSS 22軟件對不同酵母發(fā)酵的桑椹果酒的各個指標進行顯著性差異分析，應用Origin 9.0軟件對各酵母的高級醇產(chǎn)量作圖，應用MEGA 7軟件繪制S－2菌株基于18S rRNA序列的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

從桑椹自然發(fā)酵液中共分離出35株菌種，這些菌種的形態(tài)大體相同，以圖1的菌種形態(tài)為代表。從圖1中可以看出這些菌株的菌落表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地均勻柔軟，正面與反面以及邊緣與中央部位的顏色較一致，為乳白色，易挑起，有酒香味，符合酵母菌的特征［14－15］。初步鏡檢發(fā)現(xiàn)(圖 2)，細胞形態(tài)呈卵圓狀，無色透明;繁殖時期的母細胞生出小突起，為芽體(芽孢子)，經(jīng)核分裂后，一個子核移入芽體中，芽體長大后與母細胞分離，單獨成為新個體，此繁殖方式為出芽繁殖，符合酵母細胞的特征。

表1 桑椹果酒的感官評分標準Table 1 The scoring criteria for sensory evaluation of mulberry wine

圖1 YPD平板上菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology on the YPD tablet

圖2 10×40倍顯微鏡下細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology under 10×40 times microscope注:上圖顯示顯微鏡下細胞繁殖時期的分裂狀態(tài)，下圖顯示顯微鏡下單個酵母細胞的形態(tài)。

2.2 酵母菌的初篩

從酵母菌的初篩結(jié)果(表2)可以看出，12 h有10株菌種開始產(chǎn)氣，說明這些菌種的起酵速度快;24 h超過半數(shù)的菌種開始產(chǎn)氣，并且有些菌株的產(chǎn)氣量超過了杜氏小管的2/3，說明從自然發(fā)酵醪液中分離出的大部分菌種的起酵速度已經(jīng)符合果酒發(fā)酵的要求;36 h有14株菌種的產(chǎn)氣量已經(jīng)充滿了整個杜氏小管，說明這14株菌種生長良好，具有優(yōu)良的發(fā)酵能力;48 h大多數(shù)酵母的杜氏小管內(nèi)都充滿了氣泡，說明這些菌株發(fā)酵能力強。搖動大多數(shù)試管可聞到淡淡的酒香，說明這些菌株是較好的果酒發(fā)酵菌株。產(chǎn)氣充裕的菌株有33株，發(fā)酵氣味優(yōu)良的菌株有17株。其中，發(fā)酵能力強且發(fā)酵氣味愉悅的共有16株。

表2 酵母初篩結(jié)果Table 2 Results of yeasts initial screening

2.3 酵母菌的復篩

通過對初篩后的菌種進行產(chǎn)乙醇能力測試，由結(jié)果可知(表3)，產(chǎn)生乙醇含量超過10%的菌株有7株，未超過10%但大于9%的菌株有7株，小于9%的菌株僅有2株。然而產(chǎn)乙醇含量超過9%的菌株中有兩株產(chǎn)生了腐敗味，最終保留12株產(chǎn)乙醇含量超過9%且無異味的菌株。

表3 酵母產(chǎn)乙醇能力篩選Table 3 Alcohol production capacity screening of the yeasts

2.4 酵母菌的三級篩選

2.4.1 耐乙醇能力的篩選 在果汁培養(yǎng)基中添加高濃度的乙醇，可以篩選出能耐高濃度乙醇的菌株。本實驗中酵母對乙醇的耐受性如表4所示，復篩所得到的12株菌種都能在8%的乙醇環(huán)境中生長并在杜氏管中充滿氣泡。其中10株在10%的乙醇環(huán)境下依然產(chǎn)生大量的氣泡。當乙醇含量增長到12%時，還有8株菌可以生長，雖然氣泡沒有低濃度乙醇環(huán)境下多，但相比其它菌株產(chǎn)生的氣泡依然較多，說明這8株菌是能夠耐12%乙醇含量的優(yōu)良菌株。最后在含14%乙醇的環(huán)境中還有4株菌可以生存并能產(chǎn)生氣泡，說明這是極好的耐高乙醇含量的優(yōu)勢菌株。此輪篩選保留能夠耐12%乙醇含量的8株菌(包含耐14%乙醇含量的4株)。

表4 酵母菌對乙醇耐受性篩選Table 4 Alcohol tolerance ability screening of different yeasts

2.4.2 耐SO2能力的篩選 通常在果酒發(fā)酵前加入適量的SO2，可減少其他微生物對釀酒酵母的影響，確保發(fā)酵順利完成［16］。本實驗通過添加偏重亞硫酸鉀來調(diào)節(jié)桑椹汁中SO2的濃度，實驗結(jié)果(表5)顯示，經(jīng)過乙醇耐受性篩選所得的酵母菌在SO2最大實驗添加量下都生長旺盛，并且考慮到實際發(fā)酵時SO2濃度一般為40～80 mg/L，此輪篩選保留所有菌株［9］。

表5 酵母菌對SO2耐受性篩選Table 5 SO2 tolerance ability screening of different yeasts

2.5 菌株發(fā)酵力的對比分析

將篩選出的8株菌株與法國諾盟葡萄酒酵母和安琪葡萄酒酵母分別接入桑椹汁培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，檢測發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)、殘?zhí)?、總酸和揮發(fā)酸含量，并對酒體進行感官評價，結(jié)果如表6所示。

表6 十二種桑椹酒的各指標分析結(jié)果Table 6 Index analysis results of twelve mulberry wines

從表6可以看出，各菌株對糖的利用都比較完全，殘?zhí)侨夹∮?0 g/L，說明全部菌株都能正常發(fā)酵，其中S－8菌株的殘?zhí)亲畹?，?.29 g/L，發(fā)酵最完全。不同菌株發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)相差較大，其中有三株菌種的乙醇含量未達到10%，與其他菌株乙醇含量有顯著性差異(p＜0.05)，乙醇含量最高的是S－8號菌株，為11.25%，已經(jīng)充分的將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。各菌株的總酸和揮發(fā)酸的含量均符合NY/T 1508－2017［17］對果酒中總酸(4.0～9.0 g/L) 和揮發(fā)酸(≤1.0 g/L)含量的要求，只有法國諾盟葡萄酒酵母的揮發(fā)酸含量超標。通過篩選結(jié)果表明，菌株 S－2、S－3、S－8、S－9、S－26 產(chǎn)乙醇含量均在10%以上，顯著(p＜0.05)高于對照菌株的產(chǎn)乙醇含量，且上述五種菌株產(chǎn)生的總酸和揮發(fā)酸含量較低，剩余的殘?zhí)呛枯^低，感官評分較高，均是優(yōu)良的桑椹果酒酵母，適合桑椹果酒的釀造。

2.6 高級醇含量的對比

通過測定各菌株發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中的高級醇產(chǎn)生量，做出各菌株高級醇產(chǎn)生量的對比圖，結(jié)果如圖3。

圖3 各酵母菌株高級醇的產(chǎn)生量(mg/L)Fig.3 Production of higher alcohols by yeast strains(mg/L)注:不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。

桑椹果酒中的高級醇主要包括正丙醇、異丁醇和異戊醇三種，其中異戊醇所占比例較高。有研究表明在葡萄酒中總的高級醇含量在80～540 mg/L之間，含量達300 mg/L時便可產(chǎn)生令人愉快的風味，但是當含量在400 mg/L以上時，會產(chǎn)生不愉快的風味，而異戊醇會給果酒帶來不良的風味［18］。在這8株菌種中，異戊醇和總高級醇含量最低的是S－2號菌株，其異戊醇和總高級醇含量與其它菌株均呈顯著性差異(p＜0.05)。S－2號菌株的總高級醇含量為312.41 mg/L，符合本次實驗所選菌株的要求。

2.7 菌種鑒定

如圖4所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果良好。S－2菌株18S rRNA序列在BLAST中的比對結(jié)果表明，該菌與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)18S rDNA序列同源性最高，相似度達到100%。使用MEGA 7.0軟件對與S－2號菌株相似度較高的菌株進行多序列比對分析，并利用Neighbor－Joining方法制作基因系統(tǒng)進化樹。由圖5可知，S－2號菌株與釀酒酵母同源性最高，初步鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

圖4 酵母PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.4 PCR products by agarose electrophoresis of yeast注:M:DL2000 DNA ladder;1:樣品。

圖5 S－2菌株基于18SrRNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains S－2 based on 18SrRNA sequence

3 結(jié)論

本研究從桑椹自然發(fā)酵液中共分離出35株菌種，通過杜氏小管發(fā)酵法初篩，產(chǎn)乙醇能力復篩，耐乙醇和SO2能力三級篩選，得到8株產(chǎn)氣能力較強、產(chǎn)乙醇含量較高、耐受性較好的酵母菌。用這8株發(fā)酵能力較好的菌種與對照菌株分別發(fā)酵桑椹果汁，比較菌種的發(fā)酵性能和高級醇產(chǎn)量，得到1株發(fā)酵性能優(yōu)良且高級醇產(chǎn)生量低的釀酒酵母—S－2。對S－2菌種進行的研究表明，該菌起酵快、產(chǎn)氣充足，有很強的耐受性，發(fā)酵能力強，產(chǎn)乙醇含量高達10.56%，且高級醇產(chǎn)生量低，為312.41 mg/L。說明該菌完全可以取代葡萄酒活性干酵母用于桑椹果酒的發(fā)酵，也說明桑椹表皮含有的菌種可以滿足甚至更適合桑椹果酒的釀造。