吳雅倩，陳亞藍(lán)，+，馮 偉，郭志鵬，王雪青，* ，宋文軍，白小麗，李長(zhǎng)文

(1.天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)，生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134;2.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南普洱665100)

肥胖是一種多基因、多因素的復(fù)雜疾病，其本質(zhì)是能量攝入大于消耗。多余的脂肪酸和葡萄糖在脂肪細(xì)胞合成三酰甘油，并以脂滴的形式貯存在細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)三酰甘油含量超過(guò)一定限度，就會(huì)發(fā)展為肥胖。肥胖引發(fā)的脂質(zhì)代謝異常及代謝綜合征可造成肝脂肪變性、肝功能損壞，導(dǎo)致肝炎、脂肪肝、肝纖維化，更嚴(yán)重的會(huì)增加2型糖尿病和心腦血管疾病的發(fā)病率［1－2］，因此，控制體重在適當(dāng)?shù)姆秶?，是主?dòng)保持健康的最安全有效的方法。然而，一些減肥藥物，如他汀類(lèi)、貝特類(lèi)、膽汁酸螯合劑類(lèi)，會(huì)造成腸胃不適、肝臟毒素等不良反應(yīng)［3］，運(yùn)動(dòng)減肥難于持久。據(jù)報(bào)道，天然植物，包括普洱茶［4－6］、葡萄籽中的白藜蘆醇［7］、黃酮類(lèi)物質(zhì)［8］，具有減肥、降脂、降糖的功效，同時(shí)由于其毒副作用小，受到廣泛的關(guān)注。因此，利用一些藥食同源的具有減肥作用的天然植物，通過(guò)飲食進(jìn)行干預(yù)，是預(yù)防肥胖的最佳途徑之一。

普洱茶已被證實(shí)有良好的減肥降脂作用功效［9－10］，研究所采取的模型常常是先構(gòu)建動(dòng)物的肥胖模型，再給予普洱茶干預(yù)。然而，食品特別是保健品與藥物有著本質(zhì)的區(qū)別，前者對(duì)應(yīng)的是健康人群，而后者對(duì)應(yīng)的患病人群。因此，采用正常動(dòng)物模型研究普洱茶的保肝護(hù)肝作用與其實(shí)際應(yīng)用的場(chǎng)合更貼近，然而，關(guān)于其預(yù)防肥胖和保肝護(hù)肝方面的研究很少，特別是正常體重人群服用普洱茶的保健預(yù)防作用及作用機(jī)理尚未完全闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)以正常的SD大鼠為模型，通過(guò)普洱茶干預(yù)高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠后，測(cè)定大鼠肝臟中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量變化、脂質(zhì)代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)水平的變化，探討普洱茶在預(yù)防肥胖保肝護(hù)肝中的作用效果及作用機(jī)制，為普洱茶作為保健飲品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成年雄性SD大鼠 SPF級(jí)、雄性、50只，體重160～170 g/只，許可證編號(hào):SCXK－(軍)2012－0004，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;基礎(chǔ)飼料 配方為:玉米36.9%、小麥15.5%、麩皮15.5%、花生餅9.5%、豆粕15.5%、魚(yú)粉4.5%、維生素0.1%、礦物質(zhì)添加劑2.5%;高脂飼料 配方為:基礎(chǔ)飼料59.25%、豬油20%、蔗糖10%、蛋黃粉8%、全脂奶粉2%、酵母粉0.5%、維生素0.1%、微量元素0.15%，冰凍儲(chǔ)存，生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK－(軍)2002－018，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;普洱茶干粉 主要成分為茶色素(49.44%，其中茶褐素占47.32%)、蛋白質(zhì)(25.75%)以及多糖(16.74%)，云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司提供;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、50×TAE、還原型 5×SDS上樣緩沖液、30%Acr－Bis(29∶1)、0.5 mol/L Tris－HCl(pH=6.8)溶液、1.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.8)溶液 北京索萊寶科技有限公司;全蛋白提取試劑盒、引物合成 生工生物工程(上海)股份有限公司;p－AMPK單克隆抗體(兔抗鼠)、GAPDH多克隆抗體(兔抗鼠) 美國(guó) Cell Signaling Technology公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 美國(guó) Abbkine公司;DNA Ladder2000、DEPC－Treated Water 上海依科賽生物制品有限公司;Gene Green核酸染料 天根生化科技(北京)有限公司;Ribonulease Inhibitor、Agarose－ molecular Biology Grade、Trizol Reagent、M－ MLV Fist Strand Kit、SYBR Select Master Mix，life technologies;顯、定影液 天津世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司;Western發(fā)光檢測(cè)試劑盒 威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;TG、TC試劑盒 南京建成生物總公司。

3－18K高速離心機(jī) 美國(guó) Sigma公司;FHC－1200A超凈工作臺(tái) 北京國(guó)儀合信商貿(mào)有限公司;SPECTRAMAX－M5酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)MD公司;UV－1紫外透射分析儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;DYY－4C電泳儀 北京六一儀器廠;chemiDocTmXRS凝膠電泳成像儀 美國(guó)BIO－RAD;StepOnePlusTm Real－Time PCR System 美國(guó)Applied Biosystem公司;T100Tm Thermal Cyler Pcr儀 美國(guó)BIO－RAD;UV－2550型半微量紫外分光光度計(jì) SHIMADZU;Mini PRORTEAN Tera Cell電泳槽、TRANS－BLOT SD SEMI－DRY TRANSFER CELL 半干電轉(zhuǎn)儀 BIO－RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)時(shí)相對(duì)濕度40%～70%，溫度19～26℃，用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、高脂對(duì)照組、普洱茶低濃度組、普洱茶中濃度組、普洱茶高濃度組，每組10只。分組后，正常對(duì)照組繼續(xù)用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，另外4組自由采食高脂飼料喂養(yǎng)，各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間自由采食、自由飲水。同時(shí)，等體積的普洱茶以低、中、高濃度分別給予0.45、0.90、1.35 g/kg劑量干預(yù)，而正常對(duì)照組和高脂對(duì)照組灌胃等量自來(lái)水，灌胃量為0.2 mL/10 g。每日上午 9 點(diǎn)灌胃一次，連續(xù) 12 周［6，11］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組SD大鼠禁食24 h，解剖，取肝臟，用生理鹽水清洗后稱重，置于液氮速凍，最后將肝臟組織放入－80℃冰箱冷凍備用。

1.2.3 肝臟勻漿中TC和TG含量測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明制取肝組織勻漿，并測(cè)得TC和TG含量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP－1c)、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)基因表達(dá) 按照文獻(xiàn)［12］描述的方法稍作改動(dòng)。即從－80℃冰箱保存的肝臟組織，剪取50～100 mg，放入液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入液氮，迅速研磨成粉，利用Trizol試劑提取肝組織中總RNA，并于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定260 nm和280 nm下的吸光度A值，兩者比值為1.8～2.1之間，表示RNA純度高，并于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。按照試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并于20μL反應(yīng)體系中，進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)。取八連排Pcr管，加入SYBR Select Master Mix 10μL，cDNA 1 μL，上下游特異性引物各 0.6 μL(5μmol/L)，7.2 μL DEPC 水。先 95 ℃ 預(yù)變性2 min，然后95℃ 15 s、60℃ 1 min循環(huán)40次，結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線和擴(kuò)增曲線確認(rèn)特異性。應(yīng)用2－ΔΔCt法計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)量，以β－actin作為內(nèi)參，測(cè)定基因及上下游引物分別為 β－actin:5'－CGTGAAAAGATGACCCAGATCA－3'，5'－CTCCGGAG TCCATCACAATG－3';FAS:5'－GGCATTATCTTGG AAGCGATGGGTA －3'，5'－AAACTGCTCAGGACTGCG TGGG－3';SREBP －1c:5'－GCTCACAAAAGCAAA TCACTGAAAG － 3'，5'－ GCGTTTCTACCACTTCAGG TTTCA－3';HMGCR:5'－ATTGCACCGACAAGAAA CCTGCTG－3'，5'－TTC TCTCACCACCTTGGCTGGAAT－3'。

1.2.5 Western Blot測(cè)定蛋白表達(dá) 參照文獻(xiàn)［13］的方法稍作改動(dòng)。利用蛋白提取試劑盒提取肝組織中蛋白，取樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳(80 V，45～60 min后100 V至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，結(jié)束電泳)，用PVDF膜進(jìn)行半干式電轉(zhuǎn)(采用恒壓20 V進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間 GAPDH，80 min;p－AMPK，90 min)，取出PVDF膜，置于5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜(一抗稀釋倍數(shù)1∶1000)，次日加入HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG二抗(二抗稀釋倍數(shù)1∶2000)，室溫?fù)u床孵育2 h，隨后顯色、曝光、顯影、定影并于Gel－pro analyzer分析軟件中進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，相關(guān)性和顯著性分析SPSS 16.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶對(duì)肝臟中TG含量的影響

由圖1可知，大鼠經(jīng)12周的喂養(yǎng)后，高脂組大鼠肝臟中TG含量較正常對(duì)照組相比極顯著上升(p＜0.01)，與高脂組相比，普洱茶低濃度處理組肝臟中TG含量下降顯著(p＜0.05)，而中、高濃度處理組肝臟中TG含量下降極顯著(p＜0.01)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，普洱茶能有效地降低高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟中的TG含量，且作用呈劑量依賴關(guān)系。

圖1 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中TG含量的影響Fig.1 Effect of Pu－erh tea on TG content in rat liver注:##:與正常對(duì)照組相比差異極顯著(p＜0.01);#:與正常對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05);＊＊:與高脂對(duì)照組相比差異極顯著(p＜0.01);*:與高脂對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05);圖2～圖6同。

2.2 普洱茶對(duì)肝臟中TC含量的影響

由圖2表明，高脂對(duì)照組大鼠肝臟中TC含量水平較正常對(duì)照組極顯著升高(p＜0.01)。與高脂對(duì)照組比較，普洱茶處理組TC含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，低、中濃度的普洱茶組差異不顯著(p＞0.05)，而高濃度普洱茶組，TC含量由0.186 mmol/g下降到0.11 mmol/g，差異顯著(p＜0.05)。但高濃度普洱茶組大鼠肝臟中TC含量與正常對(duì)照組相比仍有上升，且差異顯著(p＜0.05)。結(jié)果表明，普洱茶可以改善高脂飼喂大鼠的肝臟內(nèi)TC含量，但達(dá)不到正常水平。

圖2 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中TC含量的影響Fig.2 Effect of Pu－erh tea on TC content in rat liver

2.3 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中 FAS、SREBP－1c、HMGCR表達(dá)水平的影響

普洱茶對(duì)大鼠肝臟中FAS表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖3。高脂對(duì)照組大鼠肝臟中FAS表達(dá)水平較正常對(duì)照組提高了280.4%，差異極顯著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高濃度組的FAS表達(dá)水平隨普洱茶濃度的提高出現(xiàn)不同程度的下調(diào)作用，且與高脂對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01)，特別是高濃度處理組FAS表達(dá)水平顯著(0.932)低于正常對(duì)照組。表明普洱茶可以降低大鼠肝臟FAS的表達(dá)水平，從而減少肝臟中脂肪酸的合成，有效預(yù)防肥胖。

圖3 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中FAS表達(dá)水平影響Fig.3 Effect of Pu－erh tea on the expression level of FASin rat liver

普洱茶對(duì)大鼠肝臟中SREBP－1c表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖4。高脂對(duì)照組大鼠肝臟中SREBP－1c表達(dá)水平較正常對(duì)照組提高了262.9%，差異極顯著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高濃度組大SREBP－1c表達(dá)水平隨普洱茶濃度的提高出現(xiàn)不同程度的下調(diào)作用，且與高脂對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01)，低、中、高濃度普洱茶對(duì)大鼠肝臟中SREBP－1c的表達(dá)水平(分別為1.163、1.019、1.015)，與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)。表明普洱茶可以降低大鼠肝臟SREBP－1c的表達(dá)水平，從而下調(diào)脂質(zhì)代謝相關(guān)因子和酶的表達(dá)水平。

圖4 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中SREBP－1c表達(dá)水平影響Fig.4 Effect of Pu－erh tea on the expression level of SREBP－1c in rat liver

HMGCR是膽固醇固醇合成途徑上關(guān)鍵限速酶。普洱茶對(duì)大鼠肝臟中HMGCR表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖5，高脂對(duì)照組大鼠肝臟中HMGCR表達(dá)水平較正常對(duì)照組提高了3.42倍，差異極顯著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高濃度組HMGCR表達(dá)水平隨普洱茶濃度的提高出現(xiàn)不同程度的下調(diào)作用，且與高脂對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01)，普洱茶低、中和高濃度對(duì)大鼠肝臟中HMGCR的表達(dá)水平與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)。表明普洱茶可以降低大鼠肝臟HMGCR的表達(dá)水平，從而有效減少膽固醇在肝臟中的合成，減輕肝臟負(fù)擔(dān)。

圖5 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中HMGCR表達(dá)水平影響Fig.5 Effect of Pu－erh tea on the expression level of HMGCR in rat liver

2.4 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中腺苷酸活化蛋白激酶蛋白(p－AMPK)表達(dá)水平的影響

甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，廣泛分布于各種組織中的細(xì)胞檢測(cè)以及作為Western Blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參［14］。普洱茶對(duì)大鼠肝臟中p－AMPK蛋白表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖6。高脂對(duì)照組大鼠肝臟中p－AMPK蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組降低了59.71%，差異顯著(p＜0.05)。普洱茶低、中、高濃度組p－AMPK蛋白表達(dá)水平隨普洱茶濃度的增加而提高，且與高脂對(duì)照組對(duì)比，差異顯著(p＜0.05)，具有劑量－效應(yīng)性。普洱茶低、中、高濃度組對(duì)大鼠肝臟中p－AMPK蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組。AMPK是預(yù)防肥胖、治療脂質(zhì)代謝紊亂的重要研究靶點(diǎn)，其能調(diào)控機(jī)體內(nèi)能量代謝，是調(diào)控多個(gè)脂肪和成和膽固醇合成相關(guān)酶的上游影響因子。本研究表明，普洱茶能激活A(yù)MPK蛋白磷酸化，繼而增強(qiáng)分解代謝。

圖6 普洱茶對(duì)大鼠肝臟中p－AMPK表達(dá)水平影響Fig.6 Effect of Pu－erh tea on the expression level of p－AMPK in rat liver注:大鼠肝臟中GAPDH、p－AMPK蛋白表達(dá)的比較(灰度);ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ分別為正常對(duì)照、高脂對(duì)照、低濃度、中濃度、高濃度組。

3 討論

SREBP－1c是脂肪合成有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的決定因子，SREEP－lc的活化可促進(jìn)FAS等成脂基因轉(zhuǎn)錄，從而參與脂肪細(xì)胞分化、增殖及機(jī)體脂質(zhì)代謝的病理生理調(diào)節(jié)［15－16］。劉姚等［17］在研究青錢(qián)柳多糖對(duì)高脂血癥小鼠脂肪酸合成酶表達(dá)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，青錢(qián)柳多糖具有抑制高脂血癥小鼠FAS基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的作用。表明青錢(qián)柳多糖通過(guò)降低FAS基因和蛋白質(zhì)表達(dá)降低高脂血癥小鼠血脂和血糖的含量。張谷等［18］在研究高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展中肝臟脂代謝關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，4、8和12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高脂大鼠中，SREEP、FAS、ACC mRNA表達(dá)水平逐漸增加。表明高脂飲食可誘導(dǎo)肝組織 SREBP－1c表達(dá)增高，過(guò)度表達(dá)的SREBP－1c引起其調(diào)控的脂肪合成相關(guān)基因ACC、FAS等活性升高，使脂肪酸合成異常增多。在本實(shí)驗(yàn)中高脂組大鼠肝臟中FAS和SREBP－1c的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，經(jīng)處理組均能降低其表達(dá)水平，減少TG含量(圖1)。表明普洱茶能夠降低SREBP－1c及其目標(biāo)基因FAS的表達(dá)，從而抑制肝臟中脂肪酸的吸收及合成。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，并通過(guò)影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量供求平衡。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)是膽固醇合成途徑的限速酶，AMPK激活后使HMGCR的ser871位磷酸化失活，導(dǎo)致膽固醇合成減少［19－20］。王會(huì)玲等［21］研究小檗堿改善糖尿病鼠糖代謝及胰島素抵抗作用及對(duì)骨骼肌線粒體功能的影響和機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，小檗堿給藥3周后，db/db小鼠的體重和脂肪墊重量均顯著降低，血糖水平下降，并使AMPK磷酸化水平顯著激活。表明小檗堿的降糖、降脂作用與激活 AMPK有關(guān)。陳彪等［22］研究黃連堿對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃連堿能下調(diào) HMGCR的mRNA和蛋白表達(dá)水平，降低TC、LDL－c水平。表明黃連堿通過(guò)下調(diào)膽固醇代謝的關(guān)鍵基因HMGCR的mRNA和蛋白表達(dá)而達(dá)到降膽固醇的效果。本實(shí)驗(yàn)中高脂對(duì)照組大鼠肝臟中HMGCR基因表達(dá)上升，而p－AMPK蛋白表達(dá)較正常正常對(duì)照組顯著降低，在普洱茶干預(yù)下，HMGCR基因的表達(dá)下調(diào)，p－AMPK蛋白水平顯著提高，從而減少了TC含量(圖2)。因此，說(shuō)明普洱茶能降低內(nèi)源性膽固醇合成，預(yù)防肥胖。

4 結(jié)論

普洱茶干預(yù)高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠能有效提高其肝臟組織中AMPK的磷酸化水平，一方面下調(diào)SREBP－1c和FAS的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到降低肝組織TG含量的作用，另一方面抑制HMGCR的轉(zhuǎn)錄水平減少TC在肝組織中的合成和蓄積，從而預(yù)防肥胖，維持肝臟正常的脂質(zhì)代謝功能，減少肝炎和非酒精性脂肪肝的發(fā)生率，有效地保肝護(hù)肝。