楊亞蘭，任佳麗，張 慧

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410002)

食用菌是可供人類食用的大型真菌，分布廣泛，世界上大型真菌有14萬種，可食用的大約有2300種，我國已知的食用菌有1000多種［1］。食用菌含有豐富的蛋白質(zhì)、粗纖維、多糖、維生素和大量的必需氨基酸。不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，還因其含有眾多的生物活性成分，如多糖、酚類、甾醇、萜類等，而具有較高的藥用價值，如調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤和降低膽固醇等功效等［2］。香菇多糖經(jīng)過測試，毒性顯示接近于零，已經(jīng)用于臨床上腫瘤的治療。因此，越來越多的食用菌被作為藥物或者保健品原料來預(yù)防和治療疾病。

萜類化合物廣泛分布在植物、動物和大型真菌中，結(jié)構(gòu)多樣，其中絕大多數(shù)具有抗炎、抑菌和抗氧化等多種生物活性，目前已報道的萜類化合物的結(jié)構(gòu)大約有50000種［3］。例如植物中具有抗瘧原蟲的青蒿素，動物中具有改善腎細(xì)胞凋亡的蝦青素和靈芝中具有抗炎作用的靈芝三萜等。食用菌中的萜類多為倍半萜、二萜和三萜，它們大多具有多種生物活性。常見的靈芝中的三萜化合物靈芝酸是重要的活性物質(zhì)，現(xiàn)已從靈芝中分離出100多種，靈芝酸能降血脂、抗氧化、抗菌抗炎、抗HIV病毒以及抗腫瘤等多種藥理活性。自然界中萜類化合物多種多樣，但是僅有一小部分被開發(fā)利用，因此，食用菌中的萜類化合物具有巨大的開發(fā)前景。本文介紹了食用菌中萜類化合物的分離純化以及鑒定方法，并整理了食用菌中具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抑菌等活性的萜類化合物，為食用菌進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 萜類化合物的定義和分類

萜類化合物是分子式為異戊二烯單位倍數(shù)的烴類及其衍生物，包括醛、酮、酯、羧酸和醇等。萜類化合物根據(jù)異戊二烯的數(shù)量來命名和分類，例如單萜(10個碳)，倍半萜(15個碳)，二萜(20個碳)，二倍半萜(25 個碳)，三萜(30 個碳)和四萜(35 個碳)［4］。常見的萜類化合物有:樟科植物中的單萜龍腦和樟腦，動物肝臟中的二萜維生素A，菊科植物中的倍半萜青蒿素以及食用菌中的三萜靈芝酸等(見圖1)。

圖1 常見萜類化合物Fig.1 Common terpenoids注:1.龍腦，2.樟腦，3.維生素 A，4.青蒿素，5.靈芝酸 A。

2 萜類物質(zhì)的提取、分離與鑒定

萜類化合物通常采用有機(jī)溶劑浸提、回流提取或者通過微波輔助提取，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等，提取的目標(biāo)成分不同，相應(yīng)的有機(jī)溶劑也不同。蕢霄云等［5］通過響應(yīng)面法得到靈芝三萜的微波提取最佳工藝，并比較微波輔助提取、超聲提取、回流提取和浸提4種提取方法的提取效果，發(fā)現(xiàn)微波處理后三萜的得率提高。食用菌中有的萜類化合物不穩(wěn)定，在提取過程中容易發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化，比如大多數(shù)乳菇屬子實(shí)體被破壞后，乳汁顏色會發(fā)生改變，其中的倍半萜就會發(fā)生轉(zhuǎn)化，一般這種情況有兩種提取方法:一種是將子實(shí)體絞碎后用有機(jī)溶劑常溫提取，得到轉(zhuǎn)化后的倍半萜，另一種是用液氮或干冰冷凍完整子實(shí)體，低溫下提取，得到原始的倍半萜［6］。

萜類物質(zhì)最常用的分離方法是柱層析分離，常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁和Sephadex。從胡克黑蛋巢菌中提取cyathane型二萜時，就是將粗提物反復(fù)過硅膠柱，以CHCl2－丙酮為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，然后TLC硅膠板進(jìn)行定性檢測，最后再經(jīng)Sephadex LH－20得到純品［7］。高效液相和氣相色譜也越來越多被用于分離萜類物質(zhì)，F(xiàn)ang等［8］利用硅膠柱和反相高效液相(RP－HPLC)分離純化出4種薁類色素。Pyysalo等［9］利用氣相色譜分離出毛頭乳菇(Lactarius torminosus)中的倍半萜。

萜類化合物作為一類重要的有機(jī)化合物，其分子結(jié)構(gòu)的檢測主要靠多種譜學(xué)技術(shù)相結(jié)合，如:液相和氣相色譜結(jié)合紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等方法，香草醛－高氯酸顯色也能對部分萜類物質(zhì)進(jìn)行定量分析。王偉等［10］以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品、香草醛－高氯酸顯色體系測定靈芝發(fā)酵菌絲體的三萜含量。高效液相色譜法通常是通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對比，根據(jù)出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定性和定量分析。賈紅巖等［11］利用高效液相色譜法同時測定不同產(chǎn)地和品種的靈芝子實(shí)體中的12種三萜成分，同時進(jìn)行了定性和定量分析。Daniewski等［12］以橄欖褶乳菇的高效液相色譜圖為標(biāo)準(zhǔn)，確定粘綠乳菇及絨白乳菇等7種乳菇的倍半萜化合物。因?yàn)檩祁愇镔|(zhì)種類較多，不斷有新化合物被分離出來，所以質(zhì)譜鑒定是最常用的方法。Gao等［13］利用浸提、柱色譜、HPLC等從靈芝中分離出了3種新的三萜醛，并通過核磁共振光譜數(shù)據(jù)確定化合物的結(jié)構(gòu)。Li等［14］從紅汁乳菇(Lactarius hatsudake)中分離出兩種薁類色素，通過光譜(2D－NMR)和質(zhì)譜(HR－TOF－MS)確定新化合物的結(jié)構(gòu)。

3 萜類物質(zhì)的生物活性

隨著對萜類化合物研究的不斷深入，萜類物質(zhì)所具有的抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抑菌等活性被發(fā)現(xiàn)，預(yù)示其在醫(yī)藥行業(yè)具有重大的開發(fā)和利用價值。

3.1 抗炎

炎癥是對機(jī)體損傷的局部組織所呈現(xiàn)的反應(yīng)，特征是功能障礙、疼痛、發(fā)熱和紅腫等。通常和病原體疾病相關(guān)，例如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、肥胖、代謝綜合癥、癌癥和心血管疾病。大量研究表明多種食用菌中的活性物質(zhì)通過減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而起到抗炎作用。

Liu等［15］從靈芝中分離出來的靈芝酸C1通過抑制TNF－α產(chǎn)生來抗哮喘，茯苓酸通過血紅素加氧酶－1(HO－1)促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化［16］。硫磺多孔菌(Laetiporus sulphureus)分離出的三萜LSM－H7，經(jīng)鑒定為乙酰齒孔酸，一定劑量的 LSM－H7能抑制RAW 264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，且在該劑量下沒有任何細(xì)胞毒性［17］。樺剝管菌(Piptoporus betulinus)中分離出的6種羊毛甾烷型三萜酸均能抑制TPA誘導(dǎo)的小鼠耳朵水腫［18］。萜類物質(zhì)抗炎機(jī)理主要是抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生達(dá)到抗炎的目的，例如非洲黑蛋巢(Cyathus africanus)、鱗蓋肉齒菌(Sarcodon scabrosus)、美味側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)和毛韌革菌(Stereum hirsutum)中萜類化合物的抗炎機(jī)理都是抑制NO的生成(詳見表1)。

表1 食用菌中有抗炎活性的萜類化合物Table 1 Anti－inflammatory terpenoids in edible mushroom

3.2 抗腫瘤

腫瘤是發(fā)病率極高的疾病，目前藥物治療雖然是臨床治療腫瘤的重要手段之一，但毒副作用較強(qiáng)，而食用菌中的多糖、蛋白質(zhì)、激素、萜類、生物堿和酚醛類等化合物是最常見的天然抗腫瘤活性成分。研究表明，活性成分的抗腫瘤機(jī)制主要是調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生命周期、抑制腫瘤細(xì)胞粘附與浸潤轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)、直接細(xì)胞毒害作用和阻斷致癌、抗突變作用等［30］。

食用菌中多種萜類物質(zhì)具有抗癌活性，輻毛鬼傘(Coprinus radians)中分離出13個guanacastane型二萜，這些化合物具有抗乳腺癌細(xì)胞活性［31］;細(xì)致乳菇中分離出的乳菇菌素對肺癌、結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌細(xì)胞有抑制作用［32］。樟芝中的麥角甾烷型三萜methylantcinate A(MAA)能夠劑量依賴性的抑制口腔癌細(xì)胞OEC－M1和OC－2的生長，且對正?？谇谎例l成纖維細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，根據(jù)流式細(xì)胞技術(shù)分析，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因Bax等增加而抗凋亡的Bcl－2和Bcl－xL表達(dá)減少，這表明MAA的抗癌可能是通過線粒體途徑進(jìn)行［33］。牛樟芝(Antrodiacamphorate)中分離出的Antroquinonol(安卓奎諾爾)對不同肝癌細(xì)胞的抗性順序?yàn)镠epG2＞Hep G2.2.15＞Mahlavu＞PLC/PRF/5＞SK－Hep1＞Hep3B，即通過活化AMPK和mTOR轉(zhuǎn)移途徑完全阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［34］，目前安卓奎諾爾被認(rèn)為是全球唯一沒有毒副作用的抗癌分子，現(xiàn)已經(jīng)用于醫(yī)療行業(yè)。Kim等［35］從亞絨白乳菇中分離出了7個lactarane型倍半萜，其中Subvellerolactone B能抑制A549、SK－MEL－2和 HCT－15的活性，而Subvellerolactone D和E只對A549和HCT－15有抑制作用。Yoshikawa等［36］從亮色乳菇中分離出新的桉葉烷型倍半萜，該倍半萜對KB細(xì)胞具有抑制作用。王濤［37］研究了靈芝三萜對前列腺癌細(xì)胞的生長影響，結(jié)果表明:靈芝三萜能明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制主要是通過調(diào)控細(xì)胞周期和減少凋亡蛋白來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡(詳見表2)。

表2 食用菌中抗腫瘤的萜類化合物Table 2 Antitumor terpenoids in edible mushroom

3.3 抗氧化

人體在代謝過程中會產(chǎn)生氧自由基，而過量的自由基會威脅人體健康，并引發(fā)一系列疾病。因此，從天然產(chǎn)物中尋找效果顯著、毒性較小的抗氧化劑是必然的選擇。研究發(fā)現(xiàn)杏鮑菇、香菇和黃牛肝菌等多種食用菌的提取物具有抗氧化活性，其有效活性成分可能是多糖、萜類和多酚等［38－40］。而食用菌中活性物質(zhì)的抗氧化機(jī)制主要有直接清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化、螯合過渡金屬離子和激活體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活性等［41］。程水明等［42］研究表明茯苓皮三萜能夠清除、·OH和H2O2，清除效果呈劑量依賴性，體外實(shí)驗(yàn)證明茯苓皮三萜能抑制雞紅細(xì)胞溶血作用和抑制小鼠肝脂質(zhì)過氧化。Wang等［43］從金針菇中分離出具有抗氧化、抗腫瘤和抑菌等活性的多種倍半萜。Yoo等［44］從毛韌革菌中分離出的倍半萜Hirsutenols E和F具有清除超氧陰離子的活性。劉曉珍等［45］研究表明黑靈芝中三萜類化合物對DPPH自由基有清除作用，對β－胡蘿卜素－亞油酸有一定的抑制作用，且對亞鐵離子的螯合作用較強(qiáng)，具有較高的抗氧化能力。

3.4 抑菌

抑菌是指能夠抑制包括細(xì)菌、真菌在內(nèi)的微生物生長的生理活性。WTO統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，腹瀉、呼吸道疾病、腦膜炎、性傳播疾病以及醫(yī)院獲得性感染等疾病均是由一些新興且抗性顯著的微生物造成的，微生物耐藥性問題亟待解決，通過對自然資源的開發(fā)利用獲得抗菌藥物是重要的途徑之一。

沈思等［46］研究表明茯苓皮三萜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有較好的抑制作用，其中對綠膿桿菌的抑菌效果受時間因素影響較大、穩(wěn)定性差。Kawagishi等［47］從猴頭菇菌絲體中分離出Erinarols J和K兩種新的化合物，而Erinacine K具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的活性;Noemia等［48］從金針菇中分離出了cuparene型倍半萜enokipodins C和D以及enokipodins A和B，這些化合物對臘葉芽枝霉、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用;從紅乳菇子實(shí)體中分離出倍半萜Rufuslactone，該倍半萜具有抑制植物病原菌作用［49］;Ofodile等［50］從靈芝中分離出了3種 colossolactones化合物，并用TLC－生物自顯影技術(shù)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) colossolactone E和23－h(huán)ydroxycolossolactone E對枯草桿菌和丁香假單胞菌有抑制作用;Shibata等［51］從鱗蓋肉齒菌中分離出了新的二萜Sarcodonin L和 Sarcodonin M，并通過紙片擴(kuò)散法確定Sarcodonin L和Sarcodonin M對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，而不抑制大腸桿菌的活性;Yun等［52］從毛韌革菌的菌絲體中分離出倍半萜hirsutenols A、B和C，這三種化合物均對大腸桿菌有中等抑制活性，而對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和鼠傷寒沙門氏菌沒有抑制活性;Intaraudom等［53］從炭褶菌屬中分離出的Aurisins A、G和K具有抗惡性瘧原蟲、蠟樣芽孢桿菌、KB細(xì)胞和NCL－H187細(xì)胞的活性。萜類物質(zhì)除了抑制一些常見的細(xì)菌和真菌外，也對結(jié)核桿菌有抑制作用，Stanikunaite等［54］從Astraeus pteridis的乙醇提取液中分離出了5種羊毛甾烷型三萜，其中兩種化合物對結(jié)合分支桿菌有中等的抑制作用(詳見表3)。

表3 食用菌中有抑菌活性的萜類物質(zhì)Table 3 Antimicrobial activity terpenoids in edible mushroom

3.5 其他活性

食用菌中萜類物質(zhì)除了抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抑菌等活性外，還具有抗 HIV－1 活性［55－58］、降血糖、神經(jīng)保護(hù)、降血脂以及植物生長促進(jìn)劑等活性［59－60］，抗瘧原蟲、降低膽固醇以及通過對神經(jīng)的保護(hù)作用來治療阿茲海默癥等［61］。

4 展望

我國雖然食用菌資源豐富，產(chǎn)量高，但大部分都是初加工產(chǎn)品，精深加工產(chǎn)品很少，附加值低。究其原因，萜類化合物種類繁多，目前研究主要集中在提取、分離、純化和鑒定以及體外活性研究等方面，而對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、純度、物化性質(zhì)、獨(dú)立作用的構(gòu)效關(guān)系、代謝途徑和作用機(jī)制等方面所開展工作較少，這極大地限制了食用菌中萜類化合物在保健品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用。因此，進(jìn)一步研究食用菌中萜類化合物降脂、降糖、降血壓、抗動脈硬化、天然抑菌劑等作用機(jī)理、功效評價和安全性評估，將食用菌充分應(yīng)用在醫(yī)藥和保健品行業(yè)，或者將食用菌加工成特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，有利于食用菌的深度開發(fā)和附加值的提升。