楊雯雋 胡蘋

細(xì)胞是生物體的基本功能和結(jié)構(gòu)單位，幾乎所有的人類疾病都涉及到細(xì)胞病變導(dǎo)致的功能紊亂與喪失。因而所有疾病治療方法的根本原則都是采用各種化學(xué)和物理的方法清除不正常細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞正常功能的恢復(fù)。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞替代治療方法（cell replacement therapy）與策略應(yīng)運(yùn)而生。細(xì)胞替代療法是指直接將細(xì)胞作為一種藥物，通過細(xì)胞移植的方法，用健康的細(xì)胞替代病變細(xì)胞對各種疾病進(jìn)行治療的方法和策略。細(xì)胞替代療法直接針對疾病產(chǎn)生的根源，理論上能夠治療所有的疾病，因而給帕金森綜合征（Parkinson disease，PD）、肌營養(yǎng)不良癥、惡性腫瘤等目前缺乏有效治療方法的退行性疾病和惡性病變的治療帶來了革命性的突破。

1 細(xì)胞替代治療中的細(xì)胞來源

1.1 功能細(xì)胞移植

細(xì)胞替代治療最直接的思路是用健康的功能細(xì)胞替代相應(yīng)的病變細(xì)胞，例如用功能正常的肌肉細(xì)胞替代病變的肌肉細(xì)胞，治療各種肌營養(yǎng)不良癥；用功能正常的多巴胺能神經(jīng)元替代病變壞死的多巴胺能神經(jīng)元，治療帕金森綜合征等。輸血就是典型的功能細(xì)胞移植替代療法。通過輸血可以將紅細(xì)胞等功能細(xì)胞移植入患者體內(nèi)，行使其功能，從而達(dá)到挽救生命的目的。這一策略的優(yōu)點(diǎn)是在邏輯上簡單直接，“頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳”，可以極大地簡化治療策略的設(shè)計(jì)，減少外在治療干預(yù)對全身各非病變組織器官的干擾，降低治療的副作用。缺點(diǎn)是體內(nèi)的很多功能細(xì)胞，例如肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、紅細(xì)胞等血液細(xì)胞等都是有絲分裂后細(xì)胞（post mitotic cells），不具有自我增殖能力。對于這些細(xì)胞而言，移植的健康細(xì)胞一旦死亡，細(xì)胞替代療法的療效即喪失，需要再次進(jìn)行細(xì)胞移植。例如，輸血后獲得的紅細(xì)胞等功能細(xì)胞能替代2～4周，無法長期維持患者機(jī)體的需求。

如何獲得大量的用于移植的具有完整功能的功能細(xì)胞一直是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域重要的基本的科學(xué)難題，也是通過直接移植健康功能細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療的主要技術(shù)瓶頸之一。即使是在非有絲分裂后的功能細(xì)胞，在體外的擴(kuò)增能力也比較弱，且在體外擴(kuò)增后還保持良好功能的能力更弱。如何實(shí)現(xiàn)功能細(xì)胞的擴(kuò)增與功能保持是細(xì)胞替代治療中亟待解決的主要問題之一。

1.2 胚胎干細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植

干細(xì)胞具有自我更新能力，且能夠分化為多種功能細(xì)胞，是進(jìn)行細(xì)胞移植的重要供體細(xì)胞來源。根據(jù)分化能力及存在時(shí)間的不同，干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell）兩種類型。顧名思義，胚胎干細(xì)胞是指從早期胚胎中分離出來的一類細(xì)胞，僅存在于胚胎發(fā)育早期。這類細(xì)胞具有在體外無限增殖、自我更新的能力，能夠分化為人體幾乎所有的細(xì)胞類型。ESC的發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。理論上，經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)，ES細(xì)胞可以分化為細(xì)胞替代療法所需的幾乎所有細(xì)胞類型，因而能夠解決細(xì)胞替代療法中的細(xì)胞來源問題。同時(shí)，ESC能夠在體外無限增殖，提供足量的細(xì)胞用于獲取功能細(xì)胞。從ESC中，我們已經(jīng)成功分化出了神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。但是，目前ESC向很多細(xì)胞類型的分化效率還有待提高，分化細(xì)胞的功能也有待進(jìn)一步完善。這也是目前干細(xì)胞研究的一個(gè)重要方向。ESC雖然有很強(qiáng)的應(yīng)用潛能，但是ESC在移植后具有致瘤性。如何降低ESC的致瘤性及提高ESC安全性是干細(xì)胞研究中的另一個(gè)關(guān)鍵問題。

ESC的獲取涉及到胚胎操作，會產(chǎn)生一定的倫理爭議。日本科學(xué)家中山伸彌（Shinya Yamanaka）團(tuán)隊(duì)在2007年首次通過過表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程，獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。隨后，科學(xué)家們在血細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、肝細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞等多數(shù)體細(xì)胞類型中過表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都獲得了iPSCs。進(jìn)一步的研究表明，上述4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子并非誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的唯一組合，其他轉(zhuǎn)錄因子、小分子也可以誘導(dǎo)iPSCs的產(chǎn)生。通過小分子誘導(dǎo)得到的iPSCs避免了過表達(dá)外源基因造成的安全性隱患，為iPSCs在細(xì)胞替代治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但是，致瘤性、分化效率低等問題依然存在，需要通過進(jìn)一步的研究加以解決。

1.3 成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞是指存在于成年個(gè)體體內(nèi)的一類干細(xì)胞。成體干細(xì)胞分布于多種已經(jīng)分化的組織類型中。目前，已經(jīng)在肌肉、血液、神經(jīng)、皮膚、脂肪、骨髓、肝、小腸、乳腺、牙齒等組織器官中鑒定到成體干細(xì)胞的存在。這類干細(xì)胞在成體組織中數(shù)量很少，通常處于靜息狀態(tài)，在組織生長與損傷修復(fù)中被激活，通過擴(kuò)增與分化，在組織再生中發(fā)揮決定性作用。這類細(xì)胞具有自我更新能力，能夠分化為所處組織器官中的一種或幾種細(xì)胞類型。例如肌肉干細(xì)胞能夠分化為肌肉細(xì)胞，血液干細(xì)胞能夠分化為紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等存在于血液中的功能細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元細(xì)胞等。成體干細(xì)胞沒有致瘤性，源于患者自身，移植時(shí)沒有組織相容性問題，能夠大大降低免疫排斥反應(yīng)。成體干細(xì)胞不涉及到胚胎操作問題，倫理爭議較少。由于成體干細(xì)胞具有上述優(yōu)點(diǎn)，因而當(dāng)前在臨床上具有比ESCs和iPSCs更廣泛的應(yīng)用。

然而，成體干細(xì)胞的應(yīng)用目前還存在一些瓶頸問題。首先，多數(shù)成體干細(xì)胞在體外擴(kuò)增困難。例如造血干細(xì)胞和肌肉干細(xì)胞都在體外難以擴(kuò)增，每次移植均需要供體提供大量組織進(jìn)行干細(xì)胞的分離與富集，因而對供體造成傷害。因此，建立成體干細(xì)胞體外規(guī)模擴(kuò)增技術(shù)是成體干細(xì)胞用于細(xì)胞替代療法的重要技術(shù)基礎(chǔ)。通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，我們研究組將肌肉干細(xì)胞在體外擴(kuò)增 1×107～1×109倍，為肌肉干細(xì)胞用于細(xì)胞替代療法奠定了基礎(chǔ)。對各種成體干細(xì)胞微環(huán)境的研究與模擬有望推動(dòng)多種成體干細(xì)胞體外擴(kuò)增系統(tǒng)的建立。其次，成體干細(xì)胞在病理和衰老條件下會發(fā)生多種性質(zhì)變化。例如，衰老的肌肉干細(xì)胞增殖能力顯著降低，移植后是否能夠在受體中有效行使功能目前還不是很清楚。第三，由于移植的細(xì)胞不是直接行使功能，患者體內(nèi)病理?xiàng)l件下的微環(huán)境可能會導(dǎo)致移植的干細(xì)胞功能降低甚至喪失。例如，病變肌肉會產(chǎn)生多種因子，阻礙肌肉干細(xì)胞的增殖、分化和存活。如何改善受體微環(huán)境，以提高移植細(xì)胞在受體中的定植能力與功能，是當(dāng)前細(xì)胞替代療法亟需解決的重要科學(xué)問題。

1.4 轉(zhuǎn)分化來源細(xì)胞

細(xì)胞具有一定的可塑性。在恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，細(xì)胞可以不需要回到ESC階段，直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪活惣?xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。例如，早在20世紀(jì)80年代，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MyoD可以使成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種非肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧∪忸愃萍?xì)胞。隨后的研究表明，過表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子組合，可以實(shí)現(xiàn)成纖維等細(xì)胞類型向肝、神經(jīng)、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)分化。這些轉(zhuǎn)分化得到的細(xì)胞在體外和體內(nèi)都具有一定的功能，成為細(xì)胞替代治療的潛在細(xì)胞來源。但是，由于涉及到一種或多種外源轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)，所以在臨床應(yīng)用中存在安全性風(fēng)險(xiǎn)。

為了解決這一問題，近年來小分子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化系統(tǒng)取得了很大的發(fā)展。用小分子取代外源轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，避免了引入外源因子，提高了所獲得的細(xì)胞的安全性。通過各種小分子組合，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從成纖維細(xì)胞向肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)分化。獲得的細(xì)胞在體外、體內(nèi)均具有一定的功能。

轉(zhuǎn)分化所得的細(xì)胞具有取材容易的優(yōu)點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)分化所得細(xì)胞的功能還需要進(jìn)一步完善。探索優(yōu)化轉(zhuǎn)分化條件，建立更高效、功能更優(yōu)的轉(zhuǎn)分化系統(tǒng)是干細(xì)胞研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

功能細(xì)胞、ESC/iPSC、成體干細(xì)胞、分化和轉(zhuǎn)分化來源的細(xì)胞作為細(xì)胞替代療法的細(xì)胞來源各有優(yōu)勢，同時(shí)也各自面臨一些瓶頸問題，需要通過進(jìn)一步的研究工作解決。本文將總結(jié)應(yīng)用上述來源細(xì)胞對來源于內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的不同組織器官的病變、損傷進(jìn)行細(xì)胞替代治療的進(jìn)展。

2 細(xì)胞替代療法治療疾病

2.1 細(xì)胞替代療法在肝臟疾病治療中的應(yīng)用

長期以來，針對終末期的肝臟疾病，急性肝損傷，肝臟移植都是唯一的治療方法。但由于供體肝源獲得困難，供體和受體之間存在排異的問題，使這一方法的應(yīng)用受到限制。細(xì)胞替代療法可以有效地替代現(xiàn)有的肝移植，起到治療多種肝臟疾病的作用。

最早的細(xì)胞替代治療是肝細(xì)胞轉(zhuǎn)輸。早在1976年，Matas等就以Gunn（先天 UDPGT酶缺失）為模型，通過肝細(xì)胞回輸?shù)姆绞接行У馗纳屏嗽撔∈骍DPGT酶的產(chǎn)生，并降低了小鼠血液中的血漿膽紅素的濃度。

基于肝細(xì)胞回輸?shù)母闻K疾病治療，目前通用的方法是將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過肝臟門靜脈或者其他途徑回輸?shù)礁闻K中，再通過補(bǔ)充外源性具備功能的肝細(xì)胞，達(dá)到維持肝臟功能的目的。肝細(xì)胞回輸，雖然已在小鼠等模式生物上有了較好的研究成果，但在臨床上，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞來源稀缺，分離困難，且體外培養(yǎng)難度大，對細(xì)胞凍存的過程又十分敏感，使用肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞回輸治療仍然有很多問題需要解決。

ESCs和iPSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞是肝臟疾病細(xì)胞替代治療的一個(gè)選擇。利用成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是肝臟疾病細(xì)胞替代治療的另一個(gè)選擇?；堇F(tuán)隊(duì)通過過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，將人和小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為功能性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并在臨床上應(yīng)用于生物人工肝。丁勝團(tuán)隊(duì)亦成功地利用成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。鄧宏魁團(tuán)隊(duì)則通過小分子同時(shí)誘導(dǎo)HNF1A、HNF4A、HNF6、ATF5、PROX1和CEBPA的表達(dá)，成功地將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)稱為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。這些誘導(dǎo)方法的建立為肝臟疾病的細(xì)胞替代治療奠定了基礎(chǔ)。

簡而言之，肝臟的細(xì)胞代替治療能有效地解決目前供體肝臟稀缺的問題。針對包括急性肝損傷在內(nèi)的疾病，肝臟細(xì)胞回輸都能起到很好的治療效果。

2.2 細(xì)胞替代療法在胰腺疾病治療中的應(yīng)用

近年來，糖尿病呈現(xiàn)高發(fā)趨勢。中國是糖尿病患者人數(shù)最多的國家，2017年患病人數(shù)達(dá)到1.14億。雖然胰島素注射可以極大地幫助糖尿病患者控制血糖，但是依然存在很多問題。通過胰腺器官移植或胰島移植的方法理論上可以達(dá)到不使用胰島素而使病情獲得良好控制的目的，并解決胰島素注射中存在的血糖濃度難以動(dòng)態(tài)調(diào)控等問題。胰腺移植已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于I型糖尿病的治療，并取得了一定的療效。但是，由于胰腺的供體非常少，阻礙了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。細(xì)胞替代療法可以幫助解決供體不足的問題。

目前主要通過人源 ESCs/iPSCs分化產(chǎn)生功能性β細(xì)胞，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來重現(xiàn)胰島中復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)及其構(gòu)成要素。由iPSCs分化得到的胰島素分泌細(xì)胞（類β細(xì)胞）能夠在體外產(chǎn)生胰島素，并在動(dòng)物模型中改善高血糖癥（hyperglycemia）。從 ESCs/iPSCs分化得到類 α-、β-、δ-等多種激素分泌細(xì)胞類型，其與內(nèi)皮細(xì)胞共同形成類器官（organoid）后移植入動(dòng)物體內(nèi)，在動(dòng)物模型中具有葡萄糖響應(yīng)功能。通過3D培養(yǎng)、類器官形成等方法，應(yīng)用多種細(xì)胞類型模擬體內(nèi)胰島的結(jié)構(gòu)和功能是當(dāng)前研究的重要方向。移植細(xì)胞在體內(nèi)的定植是另一個(gè)需要解決的問題。采用組織工程的方法把移植的細(xì)胞或類器官包裹在特殊材料的微型膠囊裝置里，一方面可以提供激素分泌功能，另一方面可以限制免疫細(xì)胞的攻擊，提高移植細(xì)胞的定植能力。這一方法目前已有一些臨床試驗(yàn)的報(bào)道。

2.3 細(xì)胞替代療法在血液系統(tǒng)疾病和腫瘤治療中的應(yīng)用

輸血是最早出現(xiàn)的細(xì)胞替代療法。早在19世紀(jì)，歐洲的醫(yī)生們就開始通過輸血嘗試治療各種嚴(yán)重失血。到20世紀(jì)初，現(xiàn)代輸血技術(shù)基本建立。直到今天，以輸血為代表的功能細(xì)胞替代療法依然是嚴(yán)重失血患者的主要治療方式。

由于血液譜系細(xì)胞獲取相對比較容易，結(jié)合長期輸血實(shí)踐獲得的大量臨床經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞移植等技術(shù)相對成熟，因而以血液譜系相關(guān)細(xì)胞移植為代表的細(xì)胞替代療法在血液疾病的治療中占據(jù)重要地位。紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板是功能細(xì)胞替代療法的主要細(xì)胞類型。

ESCs/iPSCs可以在體外誘導(dǎo)為紅細(xì)胞、T細(xì)胞、血小板等功能細(xì)胞。但是，人源血液干/祖細(xì)胞向T細(xì)胞分化時(shí)，分化效率還較低、分化效果不穩(wěn)定，重復(fù)性需要進(jìn)一步提高。目前應(yīng)用更多的是向從臍帶血中分離出的血液干/祖細(xì)胞添加多種細(xì)胞因子，使其向 T細(xì)胞誘導(dǎo)分化。這一分化系統(tǒng)中分化出的 T細(xì)胞已經(jīng)在多個(gè)臨床試驗(yàn)中用于替代患者體內(nèi)的T細(xì)胞，以治療多種白血病。目前已經(jīng)建立了用于向 T細(xì)胞分化的統(tǒng)一的臨床級iPS細(xì)胞系，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。從iPSCs分化為T細(xì)胞的方法在進(jìn)行基因編輯時(shí)有較大的優(yōu)勢。由于在iPSCs中進(jìn)行基因編輯較為方便，并且編輯過的iPSCs能夠在體外大量擴(kuò)增，因而是制備CAR-T細(xì)胞的最佳選擇。

從臍帶血中分離純化的血小板，通過血小板輸注，在臨床上已經(jīng)用于治療大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa）、Gaucher氏癥。

除了進(jìn)行終末分化的功能細(xì)胞的替代之外，也可用健康的 HSCs替代患者體內(nèi)病變的HSCs，或者由移植的健康的 HSCs在患者體內(nèi)產(chǎn)生健康的血液譜系的所有細(xì)胞，替代病變的下級細(xì)胞。這種方法已經(jīng)被廣泛用于白血病的治療。用于移植的 HSCs主要來源于捐獻(xiàn)骨髓的供體，少量HSCs可以從臍帶血中分離而獲取。HSCs細(xì)胞替代療法在免疫缺陷疾病和腫瘤中也開始有一些初步的嘗試。像多數(shù)成體干細(xì)胞一樣，HSCs在體外無法擴(kuò)增。通過添加維生素 A、視黃酸等因子，結(jié)合微載體與3D培養(yǎng)，HSCs可以得到部分?jǐn)U增。提高HSCs在體外的擴(kuò)增能力是 HSCs細(xì)胞替代療法的重要研究方向。

HSCs可以通過由ESCs/iPSCs分化而來；還可以通過轉(zhuǎn)分化以獲得。這些通過不同方式獲得的HSCs在體內(nèi)的功能完整性及安全性等方面尚需通過進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

2.4 細(xì)胞替代療法在心臟疾病治療中的應(yīng)用

人ESCs/iPSCs可以在體外誘導(dǎo)分化為心肌前體細(xì)胞以及起搏細(xì)胞（pacemaker cells）、心室細(xì)胞（ventricular cells）、心房細(xì)胞（atrial cells）等終末分化的細(xì)胞類型。應(yīng)用這些體外分化得到的細(xì)胞在動(dòng)物模型，以及豬和非人靈長類大動(dòng)物心梗模型中取得了比較好的療效。在非人靈長類心梗模型[短尾猿（macaque monkeys）心梗模型]中，從人ESCs分化來的心肌細(xì)胞在移植后能夠存活，定植3個(gè)月后，可顯著提高左心室功能。人ESCs分化得到的臨床級心血管前體細(xì)胞在初期臨床試驗(yàn)中取得了一定的療效。

心肌細(xì)胞也可以通過體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)分化獲得，并能夠在心梗動(dòng)物模型中緩解癥狀。心血管疾病的細(xì)胞替代治療中還存在很多有較大爭議的領(lǐng)域和待解決的問題，更深入的研究會對這些問題的解決提供幫助。

2.5 細(xì)胞替代療法在骨骼肌疾病治療中的應(yīng)用

各種肌營養(yǎng)不良、肌無力等肌肉退行性疾病及嚴(yán)重?fù)p傷造成的骨骼肌缺損目前均缺乏有效的治療方法。細(xì)胞替代療法為這類疾病的治療帶來了新的希望。

與其他功能細(xì)胞類似，骨骼肌細(xì)胞可以從ESCs/iPSCs誘導(dǎo)獲得。目前已經(jīng)建立了來源于杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）、假肥大型肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）、肢帶型肌營養(yǎng)不良（limbgirdle musculardystrophy，LGMD）、面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（facioscapulohumeral muscular dystrophy，F(xiàn)SHD）、強(qiáng)直性肌萎縮1（myotonic dystrophy 1，DM1）等肌肉退行性疾病患者的iPSCs。這些iPSCs的建立為進(jìn)一步的基因校正奠定了基礎(chǔ)。

由于iPSCs具有致瘤性，因此難以作為細(xì)胞替代療法的種子細(xì)胞進(jìn)行直接移植。應(yīng)用iPSCs進(jìn)行各種肌肉退行性疾病的細(xì)胞替代治療需要首先把 iPSCs誘導(dǎo)分化為肌肉譜系的細(xì)胞，然后進(jìn)行移植。通過模擬體內(nèi)骨骼肌的發(fā)育過程，ESCs/iPSCs可以分化為肌肉細(xì)胞。基因校正后的iPSCs在體外進(jìn)一步分化為肌肉前體細(xì)胞后，移植入 DMD小鼠模型中，使肌肉功能得到部分恢復(fù)。目前使用這一策略獲得肌肉細(xì)胞的主要問題是分化效率不高、分化系統(tǒng)不穩(wěn)定、批次之間差異較大。分化所得的肌肉譜系的細(xì)胞功能不完整、不穩(wěn)定，因此需要有進(jìn)一步的研究工作，以提高分化效率和分化系統(tǒng)的穩(wěn)定性，加強(qiáng)分化細(xì)胞的功能。

肌肉干細(xì)胞（肌衛(wèi)星細(xì)胞）是具有肌肉分化潛能的一類成體干細(xì)胞。肌肉干細(xì)胞位于肌膜與基底膜之間，通常處于靜息狀態(tài)。在肌肉生長和損傷修復(fù)的時(shí)候，肌肉干細(xì)胞被激活。激活的肌肉干細(xì)胞能夠進(jìn)行擴(kuò)增，并分化為具有功能的肌肉細(xì)胞。由于肌肉干細(xì)胞完全不具有致瘤性，能夠高效分化為有功能的肌肉細(xì)胞，并在體內(nèi)具有較高的整合效率，是進(jìn)行各種肌肉相關(guān)疾病細(xì)胞替代療法的理想的種子細(xì)胞。肌肉干細(xì)胞在體外擴(kuò)增困難，在體外培養(yǎng)超過 24 h后，喪失幾乎全部的干性，移植入體內(nèi)后無法定植分化為肌肉細(xì)胞。通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，我們研究組建立了肌肉干細(xì)胞在體外長期高效擴(kuò)增的系統(tǒng)。這一系統(tǒng)的建立，為肌肉干細(xì)胞于肌肉相關(guān)疾病的細(xì)胞替代治療方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

除了肌肉干細(xì)胞之外，還有一些細(xì)胞在體外具有肌向分化潛能。例如，肌肉間質(zhì)細(xì)胞、FAPs（fibrocyteladipocyte progenitors）、side population cells、血管內(nèi)皮細(xì)胞（pericytes）都在體外表現(xiàn)出一定的肌肉分化潛能。針對這些細(xì)胞進(jìn)行肌肉相關(guān)疾病的細(xì)胞替代治療，我們也開展了一些臨床試驗(yàn)。這些細(xì)胞在體內(nèi)是否具有肌向分化潛能，體內(nèi)分化細(xì)胞的功能如何，還有待進(jìn)一步研究。

2.6 細(xì)胞替代療法在腎臟疾病治療中的應(yīng)用

慢性腎病嚴(yán)重危害人類健康，目前針對腎病最有效的治療方案是腎臟移植，但是移植器官的供應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于需求。

細(xì)胞替代療法可以通過補(bǔ)充腎臟細(xì)胞，進(jìn)而重建腎臟功能。ESCs/iPSCs均具有腎細(xì)胞分化能力，體外誘導(dǎo)分化形成腎前體細(xì)胞（nephron progenitorcells）和腎小管細(xì)胞。應(yīng)用三維培養(yǎng)技術(shù)，ESCs/iPSCs可以在體外形成腎類器官。腎臟中是否存在干細(xì)胞目前還有很大的爭議。我們也可以通過轉(zhuǎn)分化的方法獲得腎細(xì)胞。目前用于細(xì)胞替代療法實(shí)驗(yàn)的主要還是由ESCs/iPSCs分化來的腎細(xì)胞。生物人工腎（bioartificial kidney，BAK）或稱腎小管輔助裝置（bioartificial renal tubule assistdevice，RAD）是指在高流量的、具有血液過濾裝置的、空心纖維管道的內(nèi)面加入一層纖維膜，經(jīng)過人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白預(yù)處理，種植哺乳類（如豬）腎小管上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞逐漸同單層細(xì)胞融合并生長，起到腎臟的作用。在狗尿毒癥實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，RAD具有腎臟的轉(zhuǎn)運(yùn)、重吸收、代謝和內(nèi)分泌功能。但這一細(xì)胞治療方案的安全性還有待評估。

2.7 細(xì)胞替代療法在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用

細(xì)胞替代療法為阿爾茲海默病和帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了新的思路。ESCs/iPSCs可以在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元/小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)滋養(yǎng)細(xì)胞，用于細(xì)胞替代治療。從iPSCs誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）已經(jīng)在 I/IIa期臨床試驗(yàn)中用于治療 ALS，通過向脊髓注射這些誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，來替代ALS患者體內(nèi)病變的星形膠質(zhì)細(xì)胞，達(dá)到治療目的。從iPSCs分化而來的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（microglial）也在臨床試驗(yàn)中用于治療ALS。

從 iPSCs誘導(dǎo)分化而來的多巴能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、astrocytes、microglia和oligodendrocytes在大動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中用于治療多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis）、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森綜合征脊髓損傷等神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病。從iPSCs誘導(dǎo)分化而來的視錐和視桿細(xì)胞在細(xì)胞替代療法中作為種子細(xì)胞治療黃斑性病變，患者視力得到明顯提高，表現(xiàn)出良好的療效。

最近的一系列研究表明，細(xì)胞替代療法不僅能夠在 AD、PD等神經(jīng)退行性疾病中替代病變的神經(jīng)元，幫助患者恢復(fù)正常的神經(jīng)元功能，而且能夠應(yīng)用于瘋牛病等prion疾病的治療中。由 iPSCs分化而來的神經(jīng)干細(xì)胞（neuronal stem cells，NSCs）、神經(jīng)祖細(xì)胞（neuronal progenitor cells，NPCs）移植入 prion疾病動(dòng)物模型中，神經(jīng)元的壽命和功能都得到了顯著的改善，提示細(xì)胞替代療法可以成為prion疾病治療的新方向。

3 細(xì)胞替代療法與基因編輯

對于很多遺傳疾病來說，自體干細(xì)胞攜帶基因突變，無法作為細(xì)胞替代療法的種子細(xì)胞。在理論上，基因編輯技術(shù)對遺傳疾病中突變的基因進(jìn)行校正可以徹底治愈所有的遺傳疾病?；蛐Ｕ袃煞N途徑。一種是體內(nèi)途徑，即將基因編輯相關(guān)病毒或質(zhì)粒直接注射入患者體內(nèi)。這種策略的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行、成本較低。早期的基因治療多數(shù)采用這種策略。這一策略的最大隱患是可能存在安全性問題。由于相關(guān)病毒或質(zhì)粒進(jìn)入人體后的行為完全無法控制，可能進(jìn)入錯(cuò)誤的組織器官，可能發(fā)生錯(cuò)誤的修改。這些副作用無法被預(yù)判，且目前也難以被控制，因而這種策略有比較大的安全隱患。此外，直接轉(zhuǎn)入體內(nèi)的病毒或質(zhì)粒等只能瞬時(shí)表達(dá)，持續(xù)時(shí)間較短，患者可能需要進(jìn)行多次注射，這更進(jìn)一步增加了安全隱患。引入人體的基因校正相關(guān)外源蛋白及病毒載體上存在的外源蛋白可能會在受體中引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，造成嚴(yán)重的副作用。

離體基因校正（ex vivogene therapy）技術(shù)可以有效地解決體內(nèi)基因治療所存在的上述問題。離體基因校正是指首先從患者體內(nèi)分離細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行基因校正，鑒定正確之后，再將基因與功能均正常的細(xì)胞移植入患者體內(nèi)。由于干細(xì)胞具有自我更新和擴(kuò)增能力，因此是進(jìn)行離體基因校正的最佳選擇。離體基因校正是在干細(xì)胞和基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上形成的交叉融合治療方法，其本質(zhì)是利用基因校正后的健康功能干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療。

由于導(dǎo)入體內(nèi)的是細(xì)胞，細(xì)胞在體外可以進(jìn)行充分的質(zhì)控與質(zhì)檢，在體內(nèi)的行為也更容易被追蹤與控制，因而大大地提高了安全性。干細(xì)胞及其分化產(chǎn)生的下級細(xì)胞可以整合入體內(nèi)，因此基因編輯后的干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞能夠在體內(nèi)長期存在，理論上采用經(jīng)過基因校正后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療可以永久治愈遺傳疾病。此外，由于離體基因校正法中引入人體的是自體細(xì)胞，不涉及外源基因的表達(dá)，因而能夠大大減輕免疫排斥反應(yīng)。雖然結(jié)合基因校正的細(xì)胞替代療法具有多種優(yōu)越性，但是也有成本高、耗時(shí)長的缺點(diǎn)。另外，這一方法的最大技術(shù)瓶頸在于很多成體干細(xì)胞在體外難以擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染/感染，因此建立干細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染/感染系統(tǒng)將極大地促進(jìn)離體基因校正法在臨床的應(yīng)用。

目前，在杜氏肌營養(yǎng)不良患者的iPSCs中進(jìn)行基因校正后，將其移植入動(dòng)物模型中表現(xiàn)出一定的療效。經(jīng)過基因校正的HSCs已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中用于白血病、鐮形細(xì)胞貧血、地中海貧血等疾病的治療，并表現(xiàn)出顯著的療效。

CAR-T療法是另一個(gè)基因修飾后進(jìn)行細(xì)胞替代治療的例子。經(jīng)過基因修飾后的 T細(xì)胞移植入腫瘤病人體內(nèi)，替代患者體內(nèi)喪失功能的T細(xì)胞，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。基因治療與干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，將進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞替代療法的發(fā)展，為人類疾病的治療提供更多的路徑和方法。

4 細(xì)胞替代治療與免疫反應(yīng)

細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞移植入患者體內(nèi)可能會引起受體的免疫排斥反應(yīng)。特別是為了降低成本，多數(shù)治療策略傾向于使用統(tǒng)一來源的“標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)胞系制備用于細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞，在移植后這些異體細(xì)胞會導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。有時(shí)移植導(dǎo)致的免疫反應(yīng)非常強(qiáng)烈，甚至?xí)＜盎颊呱?。因而在多?shù)細(xì)胞替代治療中需要給患者使用免疫抑制劑。長期使用免疫抑制劑，會產(chǎn)生一系列副作用。因此，制備低免疫原性的種子細(xì)胞是細(xì)胞替代治療研究中的重要方向。用自體細(xì)胞作為細(xì)胞替代療法的種子細(xì)胞是解決這一問題的另一個(gè)策略。但是，由于自體細(xì)胞高度個(gè)性化，因此如何降低成本是需要考慮的重要問題。

除了受體的免疫排斥之外，很多疾病都會導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生異常炎癥微環(huán)境，從而阻礙細(xì)胞替代療法中移植入的細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和定植。例如，DMD患者體內(nèi)即存在異常的高炎癥因子，如 IFNγ、IL6等炎癥因子的表達(dá)水平都很高。移植入的肌肉干細(xì)胞在這些異常高水平的炎癥因子作用下，產(chǎn)生增殖和分化障礙。因此，改善患者體內(nèi)的微環(huán)境，增加細(xì)胞替代療法所移植的種子細(xì)胞在體內(nèi)的存活率，提高移植細(xì)胞的增殖、分化和定植能力，是細(xì)胞替代療法發(fā)展過程中所必須解決的問題。

5 結(jié)語

綜上所述，細(xì)胞替代療法是在細(xì)胞生物學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)研究成果基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的醫(yī)療方式。雖然目前多數(shù)細(xì)胞替代療法還處在臨床前和臨床研究階段，但是現(xiàn)有結(jié)果清楚地表明，這一治療方法的發(fā)展、成熟將為現(xiàn)有技術(shù)帶來革命性的變化。更多的深入研究和臨床試驗(yàn)結(jié)果將幫助我們開發(fā)和鑒定更好的種子細(xì)胞，提高功能和安全性。與基因編輯等新技術(shù)的結(jié)合，將使我們獲得功能更完善、抗逆能力更強(qiáng)的細(xì)胞，以用于細(xì)胞替代治療。?

（摘自《中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)》2019年第4期）