林才瑤 Muhammad Kalim 梁可瑩 詹金彪

癌癥是全球人類所共同面臨的公共衛(wèi)生問題。多年來，癌癥治療主要為手術(shù)治療與放化療，但這些傳統(tǒng)的治療手段有一定的局限性，通常療效不佳，且其副作用還會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。腫瘤免疫治療則是一種利用免疫系統(tǒng)的固有活性來控制和消除腫瘤細(xì)胞而不攻擊正常細(xì)胞的療法。19世紀(jì)中期，德國著名病理學(xué)家Rudolf Virchow觀察到腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤提出了腫瘤免疫的概念。隨著近代腫瘤學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科迅速發(fā)展，正常機(jī)體的免疫監(jiān)視功能和腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸被逐漸揭示，腫瘤免疫治療開始興起，為腫瘤治療帶來新的希望。腫瘤免疫治療在2013年被《Science》評為年度10大科技突破之首。腫瘤免疫治療包括細(xì)胞因子調(diào)控、免疫抑制點調(diào)控、過繼性細(xì)胞回輸、腫瘤疫苗等方法。其中，嵌合抗原受體 T （chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞免疫療法是最有前景的治療方案。2017年7月，F(xiàn)DA腫瘤藥物咨詢委員會以 10∶0的投票結(jié)果一致推薦批準(zhǔn)諾華公司的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品 CTL019用于治療復(fù)發(fā)或難治性兒童和年輕成人 B急性淋巴細(xì)胞白血?。≧/RB-acute lymphoblastic leukemia，R/R BALL）。8月30日，F(xiàn)DA提前一個月正式批準(zhǔn)了諾華公司的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品Kymriah上市。

細(xì)胞毒性 T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）是目前認(rèn)為唯一具有靶向殺傷作用的淋巴細(xì)胞。CTL識別腫瘤抗原受到人類白細(xì)胞抗原分子（human leukocyteantigen，HLA）的限制，由于腫瘤細(xì)胞HLA分子表達(dá)的下調(diào)以及免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，使得CTL很難活化而無法清除腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢如下：（1）改造的CAR-T細(xì)胞識別腫瘤過程不受MHC的限制，以HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原，跨越HLA表達(dá)下調(diào)機(jī)制識別與殺傷腫瘤細(xì)胞；（2）CAR利用抗體的多樣性，不僅識別腫瘤表面的蛋白質(zhì)抗原，也能利用糖蛋白中聚糖和糖脂類抗原，有更多的腫瘤抗原靶點可選；（3）CAR-T細(xì)胞可在體內(nèi)存活較長時間，發(fā)揮持續(xù)作用；（4）使用患者自身T細(xì)胞構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞降低了排異反應(yīng)風(fēng)險。

1 CAR-T的發(fā)展歷程

CAR（chimeric antigen receptor）的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3部分組成。胞外結(jié)構(gòu)域由識別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associatedantigen，TAA）的單克隆抗體（mAb）的ScFv片段和鉸鏈組成，連接到跨膜結(jié)構(gòu)域上。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則包含TCR復(fù)合物中的CD3ζ結(jié)構(gòu)域免疫受體酪氨酸基活化模體（immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM），在識別腫瘤相關(guān)抗原后起到胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。1989年，以色列科學(xué)家Zelig Eshhar等提出把能與抗原相互識別的抗體和 TCR的信號分子融合避開MHC的限制，誘導(dǎo)T細(xì)胞特異性活化，進(jìn)而提出CAR的概念。自CAR-T的概念提出后的近30年研究中，CAR的結(jié)構(gòu)在不斷地優(yōu)化。Zelig Eshhar提出的CAR被認(rèn)為是第1代的CAR，只含有一個胞內(nèi)信號激活受體CD3ζ。T細(xì)胞的完全活化需要共刺激信號，只有完全活化的 T細(xì)胞才能進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子進(jìn)而分化和增殖。Finney等先構(gòu)建了結(jié)合激活和共刺激信號分子的第2代CAR。第2代CAR增加了如CD28、41BB、OX40或者 ICOS作為共刺激分子與CD3ζ相結(jié)合，活化相關(guān)的信號通路如ERK p38、JNK和NF-κB，使T細(xì)胞在沒有外源性共刺激分子的情況下也可以增殖。第3代CAR則結(jié)合了兩個共刺激和激活信號。擁有兩個共刺激信號的第3代CAR結(jié)構(gòu)使T細(xì)胞能夠分泌更多的細(xì)胞因子以及具有更強(qiáng)的腫瘤裂解能力。第4代CAR也稱為 TRUCK（T-cell sredirected for universal cytokine killing），被另外的可誘導(dǎo)細(xì)胞因子工程化，可以在激活的同時表達(dá)調(diào)節(jié)抗腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子（如IL-12）進(jìn)而招募并活化更多的免疫細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞，并調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

2 CAR-T的臨床應(yīng)用

2.1 血液腫瘤

CAR-T細(xì)胞首先嘗試用于治療CD19陽性的血液病腫瘤，包括復(fù)發(fā)難治性的 B急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）、慢性淋巴細(xì)胞白血病 （chroniclymphocytic leukemia，CLL）和 B細(xì)胞淋巴瘤（B-cell lymphomas）。CD19在大多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，雖然在正常 B細(xì)胞、濾泡狀樹突細(xì)胞和漿細(xì)胞中也有表達(dá)，但在造血干細(xì)胞中無表達(dá)，這使CD19成為一個很好的靶點。迄今為止，已有超過30篇出版物和大量摘要報道了CAR-T細(xì)胞在血液惡性腫瘤中的臨床試驗。2010年，Rosenberg課題組率先發(fā)表了抗 CD19-CAR-T細(xì)胞治療的臨床結(jié)果，病人在接受CAR-T治療后的39周內(nèi)未檢測到血液中的B細(xì)胞，顯示了強(qiáng)大的清除 CD19陽性細(xì)胞的能力，表明CD19-CAR-T有望是治療 B細(xì)胞惡性腫瘤的新方法。隨后，June課題組應(yīng)用CD19-CAR-T細(xì)胞（包含4-1BB和CD3ζ）成功治療了3例CLL患者。將低劑量的CAR-T細(xì)胞（1.5×105/kg）注射到慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）的患者中，輸注的 CAR-T細(xì)胞可以在患者外周血和骨髓中大量存活，相較于初始植入水平擴(kuò)增效率最高達(dá)1000倍，并檢測到CAR-T細(xì)胞在血液和骨髓中高水平持續(xù)6個月，患者外周血和骨髓中 B細(xì)胞缺失和低丙種球蛋白血癥（預(yù)期的表達(dá)CD19正常B細(xì)胞缺失引起的慢性毒性作用）也在6個月以上。治療后完全緩解（complete remission，CR）長達(dá)10個月，其中2例患者在之后2年隨訪中仍處于完全緩解。2012年，Rosenberg課題組又報道了使用 CD19-CAR-T細(xì)胞治療的 8例B-ALL研究，7例可評估患者中有6例獲得了完全緩解。文章中報道了有4例患者CAR-T治療過程中炎癥細(xì)胞因子TNF與IFNγ水平顯著升高所帶來的副作用。2014年，Maude等報道了30例（25名兒童和5名成人）患有復(fù)發(fā)難治性的B急性淋巴細(xì)胞白血?。≧/R B-ALL）的擴(kuò)大組 CTL019治療結(jié)果。在輸注CTL019 1個月后，30例患者中有27例患者達(dá)到完全緩解（90%）。治療中，所有患者都出現(xiàn)了細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokinerelease syndrome，CRS），并應(yīng)用抗白細(xì)胞介素-6受體抗體Tocilizumab應(yīng)對在27%的患者中出現(xiàn)的嚴(yán)重細(xì)胞因子風(fēng)暴。這次研究指出針對CD19的嵌合抗原受體修飾的 T細(xì)胞能有效治療復(fù)發(fā)性和難治性 ALL，CD19-CAR-T細(xì)胞有望成為不符合干細(xì)胞移植的白血病患者的替代治療方案。2015年，Brentjens等公布了44例成年 R/R B-ALL患者的臨床數(shù)據(jù)，43例可評估患者接受了 CD19-28z-CAR-T細(xì)胞治療，36例（84%）完全緩解（complete remission，CR）。36例CR患者中有35例進(jìn)行MRD分析，其中 29例（83%）達(dá)到微小殘留 MRD-CR。在 B急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）中，患者在接受抗 CD19-CAR-T細(xì)胞治療后，緩解率為70%～90%。這些數(shù)據(jù)證實了抗CD19-CAR-T細(xì)胞在成人R/R BALL患者中的抗腫瘤功效。

其他類型的白血病，CAR-T細(xì)胞治療的臨床療效不如R/R B-ALL。2015年，Kochenderfer等發(fā)現(xiàn)，15例晚期B細(xì)胞惡性腫瘤患者（9例患者彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、2例緩慢進(jìn)展淋巴瘤、4例慢性淋巴細(xì)胞性白血?。┹斪⒖?CD19-CAR-T細(xì)胞治療后，8例達(dá)到完全緩解（CR），4例達(dá)到部分緩解 （partialremission，PR），1例穩(wěn)定（stable disease，SD）。美國國家癌癥研究院（National Cancer Institute，NCI）在 CD19靶向治療 B-NHL（B-non-Hodgkin lymphoma）的 CAR-T細(xì)胞臨床試驗中顯示，累計36例可評估患者包括27例DLBCL（diffuse large B-cell lymphoma）患者顯示ORR和CR率分別為78%和44%。

2.2 實體瘤

在血液性腫瘤中，CAR-T細(xì)胞具有腫瘤靶向性好、組織毒副作用低、淋巴系統(tǒng)對腫瘤無屏障作用及T細(xì)胞的歸巢性等特點，使CAR-T細(xì)胞治療取得了很大成功。治療實體腫瘤方面仍處于臨床前研究，主要原因是實體瘤缺乏特異性的TAA靶點、存在免疫抑制微環(huán)境以及CAR-T細(xì)胞難以歸巢到腫瘤位置等因素，限制了其在實體腫瘤中的應(yīng)用。關(guān)鍵是實體瘤缺少嚴(yán)格意義上的腫瘤特異性抗原，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的抗原分子在正常的組織中往往也有表達(dá)。例如，ErbB家族中的表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）和HER2抗原，臨床上針對這兩個抗原的西妥昔單抗和曲妥珠單抗往往會表現(xiàn)出皮膚毒性和心臟毒性，原因是在上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中也有EGFR和HER2的表達(dá)。這些靶點在應(yīng)用到CAR-T治療時就需要更多安全性方面的考慮。雖然困難重重，但CAR-T的實體瘤應(yīng)用研究仍在快速發(fā)展。

雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2（disialoganglioside GD2）是在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）中高表達(dá)的表面抗原。2011年，19例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者輸注針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 GD2抗原的抗GD2-CAR-T后，3例患者達(dá)到完全緩解，顯示在治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤中有一定的抗腫瘤效果。IL13Rα2是單體高親和力 IL13受體，在GBM中選擇性表達(dá)，而在周圍的正常腦組織中不存在，因此也能作為膠質(zhì)瘤中CAR-T細(xì)胞治療的靶點。2016年，1例患有復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的患者在通過往顱內(nèi)腫瘤切除位置輸入靶向IL13Rα2的CAR-T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其腦脊液中細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞水平的相應(yīng)增加，顱內(nèi)和脊柱中轉(zhuǎn)移的腫瘤出現(xiàn)消退，并持續(xù)了7.5個月。2016年，對11例EGFR高陽性表達(dá)（＞50%）的非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者輸注遞增劑量的靶向 EGFR的CAR-T細(xì)胞，2例獲得部分緩解（PR），5例患者病情穩(wěn)定。對實現(xiàn)PR或SD的患者的腫瘤組織免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢查表明，治療后EGFR陽性腫瘤細(xì)胞被根除以及在腫瘤浸潤性T細(xì)胞中檢測到抗EGFR CAR-T細(xì)胞。2016年，1項臨床I期研究結(jié)果顯示，化療后用抗PSMA-CAR-T與IL-2輔助治療6例前列腺癌患者，其中2例患者獲得部分緩解（PR），檢測到前列腺特異抗原（PSA）分別下降了50%和70%，且預(yù)后檢測無明顯抗PSMA毒副反應(yīng)。

3 CAR-T的毒副反應(yīng)及對策

3.1 細(xì)胞因子釋放綜合征

細(xì)胞因子釋放綜合征是輸入的CAR-T細(xì)胞接觸到抗原后快速廣泛激活并導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子升高，臨床出現(xiàn)惡心、頭痛、低血壓、呼吸困難等癥狀。CRS的頻率和嚴(yán)重程度在不同的研究中有所不同。嚴(yán)重時大量細(xì)胞因子釋放會引起全身強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，造成全身器官功能紊亂甚至危及生命，稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。2010年，紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC）的Brentjens，給招募的第4名69歲難治性CLL患者輸注抗 CD19-28z-CAR-T細(xì)胞，20 h后受試者發(fā)熱，發(fā)熱持續(xù)存在并且伴隨低血壓、呼吸困難和腎衰竭綜合征。受試者在給予環(huán)磷酰胺和CAR-T細(xì)胞治療4天后死亡。目前在臨床試驗過程中應(yīng)用妥珠單抗（IL-6特異性的單克隆抗體）來控制嚴(yán)重的CRS（severe CRS，sCRS）反應(yīng)。

3.2 脫靶效應(yīng)

這種類型的毒性是正常組織中低表達(dá)的靶標(biāo)抗原同樣被CAR-T細(xì)胞特異性識別攻擊，取決于CAR-T細(xì)胞的抗原特異性。常見的脫靶效應(yīng)是用抗CD19-CAR-T細(xì)胞治療B-ALL的患者時B細(xì)胞由于CAR-T反應(yīng)持續(xù)存在導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育不良。幸運的是，血液瘤治療中引起的B細(xì)胞缺失可以由注射丙種球蛋白代替。實體瘤中由于脫靶引起的毒性則要強(qiáng)很多，嚴(yán)重的可能會危及生命。2010年，NCI構(gòu)建了基于曲妥珠單抗的抗HER2 CAR-T細(xì)胞，用于治療 HER2過表達(dá)腫瘤患者。不幸的是，在細(xì)胞輸注后15 min內(nèi)，患者出現(xiàn)呼吸困難，出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴，治療5天后死于多器官功能衰竭。CAR-T細(xì)胞治療應(yīng)用到實體瘤中，解決脫靶所引起的安全性是關(guān)鍵。最根本的是找到特異性好的腫瘤表面相關(guān)抗原，但目前缺少嚴(yán)格意義上的 TAA。科學(xué)們試圖用別的方法來控制 CAR-T的激活。導(dǎo)入自殺基因是指在CAR內(nèi)導(dǎo)入一個共表達(dá)的自殺基因，必要時激活自殺基因誘導(dǎo) CAR-T細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防或治療“脫靶效應(yīng)”。目前主要應(yīng)用的是單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和誘導(dǎo)型半胱天冬酶9（iCasp9）。HSV-TK使更昔洛韋磷酸化，磷酸化的產(chǎn)物作用于 DNA聚合酶，引起鏈終止反應(yīng)使細(xì)胞凋亡；iCasp9則通過與AP1903藥物結(jié)合啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)。另一個思路是設(shè)計 2個腫瘤表面抗原，將 T細(xì)胞活化所需的兩個信號分別與一個抗原構(gòu)建出 2個獨立的CAR，單個CAR識別與產(chǎn)生的信號不能完全活化 T細(xì)胞，從而限制了T細(xì)胞活化。這種互補(bǔ)CAR可以將T細(xì)胞活化集中在腫瘤部位。其他方法還有通過電轉(zhuǎn)將編碼 CAR的mRNA轉(zhuǎn)入到T細(xì)胞中，使CAR在 T細(xì)胞呈暫時性表達(dá)，既降低了脫靶效應(yīng)帶來的毒性又解決了病毒載體轉(zhuǎn)染帶來的相關(guān)安全性問題。也有報道對患者給予 G250mAb預(yù)處理，可有效預(yù)防“脫靶效應(yīng)”損害的發(fā)生。

3.3 實體瘤CAR-T細(xì)胞歸巢和免疫抑制腫瘤微環(huán)境

與白血病相比，CAR-T細(xì)胞在治療實體瘤中的臨床療效不佳，歸因于 T細(xì)胞難以歸巢到腫瘤部位和實體瘤高度免疫抑制微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞能夠利用多種途徑抑制免疫細(xì)胞的活性，例如腫瘤抗原缺失、共刺激信號異常、主要組織相容性復(fù)合體（MHC）類分子表達(dá)低下、腫瘤分泌的免疫抑制因子 （IL-10、TGF-B、IL-33等）以及腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制性細(xì)胞，使腫瘤微環(huán)境中的免疫系統(tǒng)處于耐受狀態(tài)，導(dǎo)致患者自身的免疫應(yīng)答常不能抑制腫瘤生長。T細(xì)胞的歸巢可以通過改變 T細(xì)胞輸注途徑，直接瘤內(nèi)注射CAR-T細(xì)胞幫助T細(xì)胞到達(dá)腫瘤位置。而要改變腫瘤免疫抑制微環(huán)境則需要其他細(xì)胞因子的幫助，如將CAR-T細(xì)胞治療與具有趨化因子RANTES和細(xì)胞因子 IL-15的溶瘤病毒結(jié)合，RANTES和IL-15的腫瘤內(nèi)釋放能夠吸引CAR-T細(xì)胞歸巢并促進(jìn) T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境存活。前文提到的第四代CAR結(jié)構(gòu)能夠共表達(dá)細(xì)胞因子如IL-12，能進(jìn)一步提高CAR-T細(xì)胞功效和在腫瘤微環(huán)境中的持久性。

3.4 其他毒性

神經(jīng)毒性癥狀從出現(xiàn)混亂、呆妄癥狀到失語、肥胖、肌陣攣和癲癇發(fā)作，這種綜合征的病因仍不清楚。它經(jīng)常伴隨CRS，但也可以單獨存在。腫瘤溶解綜合征也是CAR-T細(xì)胞治療過程中的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，由于CAR-T細(xì)胞強(qiáng)大的殺傷作用，腫瘤細(xì)胞的大量溶解，胞內(nèi)物質(zhì)快速釋放進(jìn)入血液，超過了肝臟代謝和腎臟排泄的能力，使代謝產(chǎn)物蓄積而引起高尿酸血癥、代謝性酸中毒等一系列代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常或急性腎功能衰竭而危及生命。還有治療后疾病復(fù)發(fā)的問題，很多患者在治療前期的反應(yīng)率很高，療效也非常好，但是一段時間后就會病灶復(fù)發(fā)，其原因可能與CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活時間以及腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。

4 展望

CAR-T細(xì)胞免疫治療在血液系統(tǒng)腫瘤治療中獲得了理想效果，但在實體腫瘤治療中的療效仍有待進(jìn)一步提高。尋找特異性高的TAA是CAR-T發(fā)展的關(guān)鍵。此外，科學(xué)家們也通過其他方法來積極改善CAR-T療法。主要包括以下4個方面的內(nèi)容。第一，通過基因編輯如導(dǎo)入自殺基因或功能增強(qiáng)基因（第 4代CAR）在可控的條件下誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，根據(jù)需要增強(qiáng)其功能或誘導(dǎo)其凋亡。第二，將CAR-T細(xì)胞與其他療法聯(lián)合治療也是未來的發(fā)展趨勢。例如，放化療或手術(shù)后再聯(lián)合CAR-T細(xì)胞治療以及結(jié)合其他腫瘤治療方法；與免疫檢查點抑制劑 PD1/PDL1抗體聯(lián)用以降低腫瘤細(xì)胞免疫逃逸；與溶瘤病毒聯(lián)合使用有效清除腫瘤細(xì)胞以及幫助 T細(xì)胞歸巢等。第三，通用型CAR-T療法即U-CAR-T，應(yīng)用到臨床時由于個體差異性會導(dǎo)致制備出的細(xì)胞也不相同，有些病人的 T細(xì)胞活性較差，難以制備功能性CAR-T，U-CAR-T通過敲除同種異體T細(xì)胞的MHC分子將CAR-T制成通用性“藥物” 。 Qasim等通過TALEN技術(shù)編輯T細(xì)胞受體的α鏈和 CD52基因位點來構(gòu)建通用型CAR19（UCART19），成功使兩名患有B-ALL的嬰兒在第28天達(dá)到病情緩解。2017年2月7日，美國FDA批準(zhǔn)了Cellectis公司的UCART123，以CD123為靶點針對母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤的CAR-T療法進(jìn)入臨床試驗，兩例患者中一例因嚴(yán)重的 CRS死亡，另一例則達(dá)到CR。第四，通過構(gòu)建ScFv與安全外源蛋白的 Switch融合分子來調(diào)控CAR-T?？傊?，以CAR-T細(xì)胞為主線的免疫療法，可望在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮日益重要的作用，為腫瘤患者帶來福音。?

（摘自《中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報》2018年第3期）