朱彤 吳邊

微生物組學(xué)研究一個(gè)特定環(huán)境或者生態(tài)系統(tǒng)中的微生物生態(tài)群體，而合成生物學(xué)使用工程學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的原理與方法去闡明、模擬和構(gòu)建生物制造系統(tǒng)，二者交匯，形成了合成微生物組學(xué)這一新興交叉學(xué)科。在此之前，合成生物學(xué)與基因組學(xué)交匯融合形成合成基因組學(xué)，提升了人類在基因?qū)用嫔蠈?duì)生命體的認(rèn)識(shí)水平。而合成微生物組學(xué)的研究主要集中在代謝層面和物種層面，運(yùn)用合成生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)模塊化代謝通路，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的功能菌群便是合成微生物組，可應(yīng)用于高效合成平臺(tái)化合物或復(fù)雜大分子。

傳統(tǒng)微生物發(fā)酵始于食品釀造，本質(zhì)是使用自然界的微生物菌群生產(chǎn)發(fā)酵制品，比如酒、醬油和奶酪?，F(xiàn)代微生物發(fā)酵始于20世紀(jì)40年代抗生素的生產(chǎn)，從那時(shí)起，單菌株的純培養(yǎng)成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)的主流模式，應(yīng)用于大多數(shù)氨基酸、有機(jī)酸、藥物及酶制劑等產(chǎn)品的生產(chǎn)。而后共培養(yǎng)模式再度興起，20世紀(jì)70年代維生素C二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝誕生，從L-山梨糖到 2-酮基-L-古龍酸（2-KLG）的反應(yīng)由酮基古龍酸桿菌（Ketogulonicigenium vulgare）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的共培養(yǎng)體系催化完成，前者負(fù)責(zé)合成 2-KLG，后者為前者提供氨基酸、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著合成生物學(xué)與微生物組學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)微生物共培養(yǎng)體系的研究加入了遺傳工程、代謝工程等現(xiàn)代生物技術(shù)以及工程學(xué)的模塊化思想，合成微生物組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。

1 合成微生物組的設(shè)計(jì)原理

傳統(tǒng)的功能微生物組學(xué)主要利用自然界已有的共生菌群，例如食品領(lǐng)域的釀酒菌群、環(huán)境領(lǐng)域的污水處理菌群和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的植物共生菌群等，這些菌群的物種組成十分復(fù)雜，穩(wěn)定性與魯棒性高，實(shí)現(xiàn)的是自然界已有的功能。與傳統(tǒng)的多菌株混養(yǎng)體系不同，合成微生物組學(xué)建立的多菌株共培養(yǎng)體系要求在無菌環(huán)境下接種多個(gè)確定的菌株，這些菌株的代謝通路經(jīng)過模塊化設(shè)計(jì)、改造與優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)人類賦予的、工業(yè)生產(chǎn)所需的功能。建立符合需求的合成微生物組需要經(jīng)過設(shè)計(jì)建模、菌株構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)評(píng)估、分析優(yōu)化等步驟，其中最關(guān)鍵的工作是設(shè)計(jì)模塊化代謝通路，為每個(gè)菌株分配不同的任務(wù)。合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝通路被拆分為多個(gè)模塊，每個(gè)模塊的任務(wù)由一個(gè)菌株執(zhí)行，這要求模塊間“承上啟下”的中間產(chǎn)物能夠輕松穿過細(xì)胞膜或通道蛋白，亦或由載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，從而成為連接模塊的“橋梁”。例如在D-山梨醇一步法合成2-KLG的工藝中，L-山梨糖被選為代謝通路中承上啟下的中間產(chǎn)物，K. vulgare和Gluconobacter oxydans構(gòu)成合成微生物組，后者負(fù)責(zé)將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖并為前者提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，前者再以L-山梨糖為底物合成2-KLG。

2 合成微生物組的優(yōu)勢(shì)

與單菌株培養(yǎng)相比，在設(shè)計(jì)復(fù)雜的合成代謝通路并構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，合成微生物組具有顯著的優(yōu)勢(shì)，包括，

（1）降低菌株代謝負(fù)擔(dān)與遺傳改造難度。異源表達(dá)工程菌株中，復(fù)雜大分子的合成往往需要多種外源蛋白的參與，這為單個(gè)菌株帶來了沉重的代謝負(fù)擔(dān)。模塊化設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了菌株的分工與合作，單個(gè)菌株只需表達(dá)一部分外源蛋白，降低了各菌株的代謝負(fù)擔(dān)，同時(shí)一定程度上降低了遺傳改造的難度。

（2）提供多樣的元件表達(dá)平臺(tái)。設(shè)計(jì)合成微生物組時(shí)，可以為每個(gè)代謝通路模塊選擇最適合的菌株來表達(dá)所需的酶，大腸桿菌（Escherichia coli）等原核生物難以表達(dá)的酶可以用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來表達(dá)，從而構(gòu)成細(xì)菌-酵母共培養(yǎng)體系。

（3）“即插即用”的模塊替換。將合成代謝通路模塊化后，每個(gè)菌株可完成一個(gè)獨(dú)立模塊的工作，更換上游模塊的菌株即可改變初始底物，更換下游模塊的菌株即可改變最終產(chǎn)物，增加下游模塊即可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)一步加工。

（4）平衡各模塊的合成能力。改變各菌株的接種比例，可以調(diào)整代謝模塊之間的相對(duì)強(qiáng)度，平衡各模塊的合成能力，提高整體合成效率。

（5）降低副產(chǎn)物的生成量。在共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞膜在模塊之間形成屏障，這種物理隔離可以減少代謝通路之間的干擾，從而減少副產(chǎn)物的生成。

（6） 實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜底物的利用。例如，木質(zhì)纖維素降解得到的糖類為五碳糖和六碳糖的混合物，單菌株由于具有底物偏好性，對(duì)混合底物的利用效率不高，而合成微生物組的各個(gè)菌株可改造成利用不同碳源，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合單糖的高效利用。

3 合成微生物組的研究進(jìn)展

3.1 同種微生物組成的合成微生物組

相比于單菌株培養(yǎng)，合成微生物組能有效減少中間產(chǎn)物的積累，提高產(chǎn)物合成效率。Zhang等人建立了以葡萄糖和木糖為碳源，合成順，順-己二烯二酸的E. coli-E. coli共培養(yǎng)體系，將合成途徑拆分為兩個(gè)模塊，E. coliP6.2以木糖為碳原合成（-）-3-脫氫草酸，E. coliBXS/BXC以葡萄糖為碳原，以（-）-3-脫氫草酸為底物合成順，順-己二烯二酸。這樣的分工提高了混合單糖的利用效率并減少了中間產(chǎn)物的積累，順，順-己二烯二酸的產(chǎn)量從單菌株培養(yǎng)的36 mg/L提升至682 mg/L。進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件后，1 g葡萄糖木糖混合物可生產(chǎn) 0.35 g順，順-己二烯二酸，碳源換為甘油后產(chǎn)量可達(dá)2 g/L。

在合成木質(zhì)素單體的單菌株培養(yǎng)體系中，反應(yīng)底物酪氨酸除了在酪氨酸解氨酶的催化下形成中間產(chǎn)物香豆酸之外，還會(huì)被合成途徑下游的羥化酶HpaBC催化形成副產(chǎn)物左旋多巴并進(jìn)一步氧化，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。Chen等人將該合成途徑拆分為兩個(gè)模塊，建立了E. coli-E. coli共培養(yǎng)體系，酪氨酸解氨酶和羥化酶HpaBC分別在不同菌株中表達(dá)，細(xì)胞膜作為屏障減少了酪氨酸與羥化酶HpaBC接觸的機(jī)會(huì)，副產(chǎn)物大幅減少，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量與單菌株培養(yǎng)相比提高了12倍。

合成微生物組能夠降低菌株代謝負(fù)擔(dān)，減少對(duì)菌株正常生理代謝的影響，從而提高產(chǎn)量。Jones等人建立了E. coli-E. coli共培養(yǎng)體系用于生產(chǎn)黃酮類化合物，將類黃酮代謝通路拆分為兩個(gè)模塊，使得黃烷-3-醇的產(chǎn)量與單菌株培養(yǎng)相比提高了970倍。在該體系的基礎(chǔ)上，Jones等人又增加了兩個(gè)模塊，建立了由4株E. coli組成、表達(dá)15種外源蛋白的共培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)了花青素的異源從頭合成。除了上述研究，也有文獻(xiàn)報(bào)道3-氨基苯甲酸、柚皮素、洛伐他汀等產(chǎn)品通過建立同種微生物組成的合成微生物組，降低菌株代謝負(fù)擔(dān)，產(chǎn)量與單菌株培養(yǎng)相比分別提高了15，1.5，0.7倍。

3.2 異種微生物組成的合成微生物組

異種微生物組成的合成微生物組可以提供多樣的元件表達(dá)平臺(tái)。氧化紫杉烷是抗癌藥物紫杉醇的前體，其合成途徑源于植物。大腸桿菌難以表達(dá)復(fù)雜的真核生物的酶，而釀酒酵母合成類異戊二烯的能力較低，二者均不能單獨(dú)合成氧化紫杉烷。Zhou等人建立了E. coli-S. cerevisiae共培養(yǎng)體系，將氧化紫杉烷的合成途徑拆分為兩個(gè)模塊，E. coli負(fù)責(zé)合成紫杉烯，之后S. cerevisiae以紫杉烯為底物合成氧化紫杉烷，培養(yǎng)120 h后氧化紫杉烷產(chǎn)量達(dá)到33 mg/L。

如果光合細(xì)菌參與構(gòu)成合成微生物組，那么這個(gè)共培養(yǎng)體系可將光能當(dāng)作能量來源，不需要額外碳源便可持續(xù)合成產(chǎn)品。Weiss等人建立了細(xì)長(zhǎng)聚球藻（Synechococcus elongatus）和鹽單胞菌（Halomonas boliviensis）的共培養(yǎng)體系，以光能為能量來源合成生物材料聚-β-羥丁酸。在不添加額外碳源的情況下，細(xì)長(zhǎng)聚球藻通過光合作用合成蔗糖并分泌至胞外，鹽單胞菌攝入蔗糖后用于生長(zhǎng)和合成聚-β-羥丁酸。該共培養(yǎng)體系可維持 5個(gè)月，聚-β-羥丁酸產(chǎn)量達(dá)到了28.3 mg/（L d）。

合成微生物組也被應(yīng)用到了生物電化學(xué)領(lǐng)域。Liu等人建立了由E. coli、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）組成的三菌株共培養(yǎng)體系以輸出電能。E. coli生產(chǎn)作為電子供體的乳酸，B. subtilis生產(chǎn)作為電子穿梭體的核黃素，S. oneidensis作為產(chǎn)電菌持續(xù)輸出電能，乳酸氧化形成的乙酸還可以作為碳原再次被細(xì)菌利用。這個(gè)生物電化學(xué)系統(tǒng)最終持續(xù)輸出電能 15 d，能量轉(zhuǎn)化效率高達(dá)55.7%。除此之外，也有文獻(xiàn)報(bào)道利用B. subtilis-S. oneidensis和S. cerevisiae-S. oneidensis等雙菌株共培養(yǎng)體系組建的生物電化學(xué)系統(tǒng)。

在生物質(zhì)綜合利用和生物燃料領(lǐng)域，合成微生物組也受到了研究者的廣泛關(guān)注，被應(yīng)用于各種生物燃料與有機(jī)溶劑的生產(chǎn)。農(nóng)作物秸稈、玉米芯、甘蔗渣等植物材料富含纖維素和半纖維素，數(shù)量巨大且價(jià)格低廉，是潛在的生產(chǎn)生物燃料和其他化學(xué)品的原料。將纖維素降解途徑和生物燃料合成途徑拆分為兩個(gè)代謝模塊，由兩個(gè)菌株分工完成，既能減輕單個(gè)菌株的代謝負(fù)擔(dān)，又能降低遺傳改造的難度。據(jù)此，部分研究者設(shè)計(jì)了同種合成微生物組，更多的研究者為了充分發(fā)揮物種優(yōu)勢(shì)，選擇設(shè)計(jì)異種合成微生物組。在異種合成微生物組中，降解纖維素的工程菌一般來自梭菌屬或木霉屬，而合成生物燃料或其他化學(xué)品的工程菌一般是遺傳改造常用的大腸桿菌、酵母菌或梭菌。

4 挑戰(zhàn)與機(jī)遇

近年來，合成微生物組的研究成果逐年快速增長(zhǎng)，但大多數(shù)還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有一定距離，并且絕大多數(shù)合成微生物組由兩個(gè)菌株組成，多菌株合成微生物組為數(shù)寥寥。無論是應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，還是增加共培養(yǎng)菌株數(shù)量，合成微生物組都面臨著一系列挑戰(zhàn)，首先便是維持共培養(yǎng)體系的穩(wěn)定。調(diào)整各菌株的初始接種比例是控制各模塊代謝強(qiáng)度的一種方法，但各菌株生長(zhǎng)速率存在差異，生長(zhǎng)速度快的菌株若不加以控制，便會(huì)出現(xiàn)“一家獨(dú)大”的情形，導(dǎo)致模塊代謝強(qiáng)度失衡，產(chǎn)率降低。對(duì)生長(zhǎng)快速的菌株加以限制，最常用的策略是建立群體感應(yīng)（quorum sensing）系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)菌株對(duì)生長(zhǎng)的自主限制。群體感應(yīng)系統(tǒng)由3部分組成，其功能分別是分泌作為誘導(dǎo)物的信號(hào)分子、檢測(cè)環(huán)境中信號(hào)分子的濃度以及調(diào)控生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)。信號(hào)分子在環(huán)境中擴(kuò)散，當(dāng)細(xì)胞密度較大、信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值時(shí)，啟動(dòng)生長(zhǎng)相關(guān)基因的調(diào)控。Scott等人將群體感應(yīng)系統(tǒng)運(yùn)用于兩株鼠傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium）的共培養(yǎng)體系，當(dāng)單個(gè)菌株的細(xì)胞密度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)，該菌株細(xì)胞裂解相關(guān)基因的表達(dá)便被啟動(dòng)，80%的實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)48 h時(shí)仍能保證兩菌株共存，而不具有群體感應(yīng)系統(tǒng)的共培養(yǎng)體系無法維持超過 12 h。另一種限制菌株生長(zhǎng)速度的策略是建立菌株互養(yǎng)（cross-feeding）的共培養(yǎng)體系，即各菌株均為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，需要共培養(yǎng)的其他菌株提供其自身無法合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Mee等人為發(fā)展微生物共培養(yǎng)體系建立了一個(gè)平臺(tái)，構(gòu)建了14株?duì)I養(yǎng)缺陷型E. coli，每株菌株缺失一種氨基酸合成能力，這些菌株可以組成兩菌株或三菌株共培養(yǎng)體系，從而在M9-葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。但目前同時(shí)做到生長(zhǎng)偶聯(lián)與設(shè)計(jì)代謝途徑偶聯(lián)的工作尚無報(bào)道。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，共培養(yǎng)體系可能遇到諸如培養(yǎng)環(huán)境改變、外來菌株競(jìng)爭(zhēng)、基因突變、水平基因轉(zhuǎn)移等問題。如何在發(fā)酵生產(chǎn)期間保持共培養(yǎng)體系的功能不受過多影響，即如何提高合成微生物組的魯棒性，是合成微生物組面臨的另一挑戰(zhàn)。首先是遺傳穩(wěn)定性問題，合成微生物組包含多個(gè)菌株，與單菌株培養(yǎng)相比更容易受基因突變影響，若一個(gè)菌株因遺傳物質(zhì)改變而失去設(shè)定的代謝功能，整個(gè)共培養(yǎng)體系便無法生產(chǎn)最終產(chǎn)物。為了提高遺傳穩(wěn)定性，在設(shè)計(jì)合成微生物組的階段應(yīng)特別關(guān)注遺傳改造方案，注意優(yōu)先使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、避免過多的基因重復(fù)序列等。其次是外來菌株競(jìng)爭(zhēng)的問題，當(dāng)存在未被占據(jù)的代謝生態(tài)位時(shí)，外來菌株便有可能入侵并繁殖，因此設(shè)計(jì)合成微生物組時(shí)應(yīng)注意使底物被充分利用，例如讓各菌株分別利用不同碳原以提高混合底物的利用率。

增加組成合成微生物組的菌株數(shù)量，不僅要考慮到共培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性與魯棒性，還需要考慮到體系是否容易調(diào)控。調(diào)控含有更多菌株的合成微生物組需要更加復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，目前研究者寄希望于合成生物學(xué)進(jìn)一步發(fā)展，獲得正交性、控制性更好的合成生物學(xué)工具，例如上文所說的群體感應(yīng)系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株互養(yǎng)系統(tǒng)。合成生物學(xué)中使用的“邏輯門”等設(shè)計(jì)思想也可延伸到物種層面，通過初級(jí)代謝偶聯(lián)和次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制等方法，在共培養(yǎng)體系中模擬出自然界的競(jìng)爭(zhēng)、共棲和互利共生等種間關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)合成微生物組的自我調(diào)控。

建立含有更多菌株的共培養(yǎng)體系，除了設(shè)計(jì)合成微生物組時(shí)使用的“自下至上”（bottom-up）的設(shè)計(jì)方式，還有一種“自上至下”（top-down）的設(shè)計(jì)方式，即向自然學(xué)習(xí)，從自然界已有的共生菌群出發(fā)，刪去功能冗余和不重要的菌株，僅保留能夠?qū)崿F(xiàn)共生菌群功能的關(guān)鍵菌株，得到“最小必要菌群”（minimal microbial communities）。以這種方式得到的共培養(yǎng)體系具有較好的穩(wěn)定性與魯棒性，基本保留了原菌群的功能，主要的應(yīng)用集中在降解木質(zhì)纖維素等自然界已有的功能。雖然最小必要菌群目前可應(yīng)用的范圍不大，但對(duì)其研究有助于我們了解共培養(yǎng)體系中菌株之間的相互作用，進(jìn)而指導(dǎo)建立含有更多菌株，穩(wěn)定性和魯棒性更高的合成微生物組。

5 展望

繼基因組、蛋白質(zhì)組之后，微生物組成為了生物學(xué)研究的又一個(gè)焦點(diǎn)領(lǐng)域，美國(guó)于2016年5月公布了國(guó)家微生物組計(jì)劃，中國(guó)科學(xué)院也于2017年 12月啟動(dòng)了中國(guó)科學(xué)院微生物組計(jì)劃。合成微生物組學(xué)的出現(xiàn)，為工業(yè)生物技術(shù)的升級(jí)改造帶來了新的可能性。受益于合成生物學(xué)與微生物組學(xué)的快速發(fā)展，合成微生物組的研究在近幾年取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，相關(guān)研究成果的數(shù)量逐年快速增長(zhǎng)。雖然大多數(shù)研究成果還沒有在生產(chǎn)中取得正式應(yīng)用，但伴隨更多合成生物學(xué)工具的創(chuàng)新與優(yōu)化，以及對(duì)天然微生物組更加深入的理解，合成微生物組的穩(wěn)定性、魯棒性將會(huì)得到改善，逐漸縮小與生產(chǎn)應(yīng)用的距離，形成對(duì)當(dāng)前單菌株微生物工業(yè)生產(chǎn)模式的互補(bǔ)。隨著更多的理論研究創(chuàng)新與應(yīng)用案例出現(xiàn)，合成微生物組學(xué)的技術(shù)很有可能成為未來生物產(chǎn)業(yè)新突破的動(dòng)力源泉。

（摘自《科學(xué)通報(bào)》2019-02-25 網(wǎng)絡(luò)版發(fā)表）