張鴻 梁順 杜玥 竇曹帥 張麗 談錦萍 劉雙信 梁馨苓 章斌，

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510282）；2廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（廣州510080）

足細(xì)胞脫落和足突融合是足細(xì)胞損傷的主要形式，也是腎小球疾病發(fā)生蛋白尿的主要原因之一。近年來足細(xì)胞研究［1］有大量報道，但其損傷機(jī)制未完全清楚。核因子κB受體活化因子（receptor activation of nuclear factor kappa B，Rank）是腫瘤壞死因子受體超家族I型跨膜蛋白，在破骨細(xì)胞的生成、淋巴細(xì)胞的發(fā)育［2］、乳腺癌的發(fā)生［3］等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在人類腎小球疾病患者及足細(xì)胞損傷動物模型中都發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷時，Rank 表達(dá)明顯升高［4］；也有研究［5］報道Rank介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷；這些研究提示Rank在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要的作用，但是其具體的分子機(jī)制仍不清楚。活化T細(xì)胞核因子（nu?clear factor of activated T?cells，NFAT）活化是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、凋亡、腎小球硬化的關(guān)鍵信號分子［6-9］。瞬時受體電位通道 6（transient receptor poten?tial channel 6，TRPC6）是足細(xì)胞膜通道蛋白，TRPC6的激活導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，鈣調(diào)磷酸酶活化，NFATc1去磷酸化入核增加，加劇足細(xì)胞損傷［10］。本研究擬探究Rank對足細(xì)胞的效應(yīng)及其機(jī)制是否與TRPC?NFATc1信號通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料RMPI 1640培養(yǎng)基（CORNING）；胎牛血清FBS、0.05%胰酶（Gibco）；重組小鼠γ干擾素IFN?γ（ProSpec）；Rank siRNA（廣州銳博）；核漿蛋白提取試劑盒（凱基）；podocin抗體、Ionomycin（Sigma）；Rank、NFATc1、TRPC6抗體（Abcam）；GAPDH 抗體（Bioworld）；Synaptopodin抗體（Santa）；Histone抗體（CST）；熒光二抗488、熒光二抗555、Co?IP試劑盒（Thermo）；SYBR GREEN（Takara）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、lipofectamine 2000（Life Tech?nologies）。

1.2 足細(xì)胞培養(yǎng)條件性永生化小鼠足細(xì)胞系由美國J.RESIER教授（Rush University Medical Cen?ter，Chicago，IL，USA）惠贈。足細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%FBS及（2～10）×104U/L的 IFN?γ培養(yǎng)基在33℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞融合達(dá)到75%～85%時轉(zhuǎn)入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中用5%FBS及不含IFN?γ的培養(yǎng)基中分化，在37℃培養(yǎng)10～12 d，足細(xì)胞分化成熟。所有足細(xì)胞實驗均在分化成熟后進(jìn)行。

1.3 實驗分組（1）Ionomycin干預(yù)分組：Con組（空白對照組）、ionomycin組（ionomycin干預(yù)24 h）；（2）Rank沉默效率驗證分組：Con組（空白對照組）、Scramble組（陰性對照組，Con?siRNA干預(yù)24 h）、Rank?siRNA#1、Rank?siRNA#2、Rank?siRNA#3（分別由對應(yīng)Rank?siRNA干預(yù)24 h）；（3）沉默Rank表達(dá)后分組：Con組（Ionomycin干預(yù)24 h）、Scramble組（Con?siRNA干預(yù)24 h后加入Ionomycin干預(yù)24 h）、Rank?siRNA#2組（Rank?siRNA#2干預(yù)24 h后加入Ionomycin干預(yù)24 h）。

1.4 細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片分化成熟后，用冰甲醇固定15 min，再用Triton X?100透化10 min，5%胎牛血清蛋白封閉30 min，孵育一抗在4℃搖床過夜，第2天避光孵育相應(yīng)二抗及細(xì)胞核染料DAPI，用防熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染將50 nmol/L siRNA、250 μL opti?mem培養(yǎng)基與8 μL lipofectamine 2000、250 μL opti?mem培養(yǎng)基混勻靜置20 min，再加入含3.5 mL的無血清培養(yǎng)基細(xì)胞中，6 h后更換普通培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。

1.6 Western印跡細(xì)胞成熟后加入蛋白裂解液（提取核蛋白加入核蛋白裂解液）刮取蛋白，用BCA法測量蛋白濃度，98℃10 min變性蛋白。制備合適濃度Western膠后，蛋白上樣，80 V電泳，200 mA 120 min電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。再用5%牛奶封閉30 min，一抗4℃孵育過夜。第二天孵育相應(yīng)二抗，化學(xué)發(fā)光液曝光，Image J軟件分析灰度值。

1.7 熒光定量PCR用Trizol提取mRNA，測定濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書使mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cD?NA，按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)。引物序列如下：Rank 正義鏈 5′?CCAGGAGAGGCATTATGAGC?A?3′，反義鏈 5′?ACTGTCGGAGGTAGGAGTGC?3′；GAPDH 正義鏈5′?AGGTCGGTGTGAACGGATTTG?3′，反義鏈 5′?TGTAGACCATGTAG TTGAGGTCA?3′。

1.8 免疫共沉淀（Co?IP）預(yù)冷PBS刮取蛋白后用細(xì)胞裂解液裂解（保留蛋白間連接），用磁珠Protein G封閉30 min，留取少量蛋白為Input組，加入Rank抗體特異吸附Rank蛋白復(fù)合體，4℃搖床過夜。加入磁珠Protein G與抗體Rank結(jié)合孵育30 min，用磁力架把磁珠Protein G?Rank抗體—Rank蛋白復(fù)合體拉下來，洗脫磁珠，變性蛋白，Western印跡檢測TRPC6蛋白。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞Rank在Ionomycin刺激下表達(dá)增多用Ionomycin干預(yù)足細(xì)胞24 h后，熒光定量PCR及Western印跡結(jié)果均顯示與Con組相比，Ionomycin組足細(xì)胞中Rank表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見圖1A、1B。足細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示Ionomycin組中Rank表達(dá)明顯增加。見圖1C。

2.2 沉默Rank表達(dá)減少足細(xì)胞損傷通過熒光定量PCR篩選siRNA沉默效率，結(jié)果顯示Rank?siRNA#2的沉默效率最好，同時進(jìn)一步通過West?ern印跡驗證Rank?siRNA#2的沉默蛋白表達(dá)效率也較高（P＜0.05）。見圖2A、2B。Podocin是腎小球足細(xì)胞特異表達(dá)的跨膜蛋白，在維持足細(xì)胞形態(tài)和裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮重要作用，Podocin蛋白表達(dá)下降是足細(xì)胞損傷的特征性標(biāo)志［11］。通過沉默足細(xì)胞Rank表達(dá)（本研究后續(xù)沉默Rank實驗均使用Rank?siRNA#2）后，在Ionomycin損傷刺激下，足細(xì)胞標(biāo)記蛋白Podocin表達(dá)較Con組上調(diào)（P＜0.05）。見圖2C。

2.3 沉默Rank表達(dá)足細(xì)胞核NFATc1表達(dá)下調(diào)沉默Rank及Ionomycin干預(yù)后，Western印跡顯示Rank?siRNA#2組足細(xì)胞核NFATc1蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖3A。同樣干預(yù)下，足細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示NFATc1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，Rank?siRNA#2+Ionomycin組細(xì)胞核內(nèi) NFATc1表達(dá)減少。見圖3B。

圖1 Ionomycin誘導(dǎo)足細(xì)胞Rank表達(dá)Fig.1 The expression of RanK was upregulated in ionomycin?treated podocytes

圖2 沉默Rank減少足細(xì)胞損傷Fig.2 Loss of RanK ameliorates podocyte injury

圖3 沉默Rank后足細(xì)胞核NFATc1表達(dá)減少Fig.3 Loss of RanK decreased nuclear localization of NFATc1 in injured podocytes

2.4 Rank通過結(jié)合TRPC6調(diào)控其表達(dá)沉默TRPC6并干預(yù)Ionomycin后，Western印跡顯示TRPC6蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖4A。通過Co?IP實驗檢測Rank及TRPC6間關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明Rank蛋白結(jié)合TRPC6蛋白形成復(fù)合體，且在Ionomycin刺激下形成更多Rank?TRPC6復(fù)合體。見圖4B。

圖4 Rank結(jié)合TRPC6并調(diào)控其表達(dá)Fig.4 RanK binds to TRPC6 and regulates its protein expression

3 討論

足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同構(gòu)成了腎小球濾過膜屏障，是腎小球濾過膜屏障的關(guān)鍵組成部分。足細(xì)胞損傷幾乎參與了所有腎小球疾病的病理改變，也是臨床治療的重要靶點［12-13］。因此，闡明足細(xì)胞的損傷機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

Rank是TNF受體超家族成員，RankL是其配體，Rank/RankL/OPG（骨保護(hù)素）是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、發(fā)育及成熟的關(guān)鍵信號通路［14-15］。同時大量研究表明Rank?RankL在免疫系統(tǒng)［2］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)［16］、乳腺癌發(fā)生［17］等都有重要作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Rank在足細(xì)胞中也具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在IgA腎病、膜性腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化患者足細(xì)胞中Rank表達(dá)都比正常腎組織足細(xì)胞中增多，在嘌磷霉素（PAN）及脂多糖（LPS）造模的蛋白尿模型腎小球足細(xì)胞中也誘導(dǎo)Rank表達(dá)上調(diào)［4］。CHEN等［5］研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激可誘導(dǎo)足細(xì)胞Rank表達(dá)上調(diào)。Ionomycin是一種鈣離子載體，高度選擇性結(jié)合鈣離子以提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷［6］。本研究通過Ionomycin誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，也同樣發(fā)現(xiàn)Ionomycin刺激下足細(xì)胞Rank在mRNA水平、蛋白水平都表達(dá)上調(diào)。足細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示Ionomycin刺激下足細(xì)胞Rank表達(dá)增加。

進(jìn)一步探究足細(xì)胞損傷情況下Rank表達(dá)增加的效應(yīng)，本研究觀察腎小球足細(xì)胞特異表達(dá)的跨膜蛋白Podocin情況。Podocin具有離子通道和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在維持足細(xì)胞形態(tài)和裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮著不可或缺的作用，在足細(xì)胞損傷情況下，標(biāo)記蛋白Podocin表達(dá)減少［11］。通過篩選沉默效率高的siRNA沉默足細(xì)胞Rank表達(dá)后，在Ionomycin誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷情況下沉默Rank使標(biāo)記蛋白Podocin表達(dá)上調(diào)，即可部分逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞損傷。可見足細(xì)胞中Rank表達(dá)增多可加劇足細(xì)胞損傷。但Rank是通過何種機(jī)制介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的，目前并不是很清楚。課題組近年來研究發(fā)現(xiàn) NFATc1 是足細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因子［6-7，9，18-19］。轉(zhuǎn)錄因子NFAT分子家族有五個亞型，即NFAT1?5，除NFAT5外其他成員（NFAT1?4）都受鈣離子—鈣調(diào)磷酸酶酶（calcineurin，CaN）信號通路調(diào)節(jié)［20］。在靜息細(xì)胞中，NFAT主要在細(xì)胞質(zhì)中保持高度的磷酸化穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，Ca2+內(nèi)流增加，活化CaN，Ca2+/CaN使NFAT去磷酸化進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，NFAT與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、生長［20］。在足細(xì)胞中，大量研究［7?8，21］表明CaN?NFAT信號通路的活化是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、腎小球硬化的主要重要因素。臨床上對絕大多數(shù)腎小球疾病具有降尿蛋白、保護(hù)足細(xì)胞作用的環(huán)孢素A正是通過抑制CaN活化而發(fā)揮作用［22］，這也進(jìn)一步證實NFAT對足細(xì)胞損傷具有重要意義。本研究沉默足細(xì)胞Rank表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Ionomycin刺激下細(xì)胞核內(nèi)的NFATc1蛋白表達(dá)減少。細(xì)胞免疫熒光也證實：Ionomycin刺激下NFATc1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯，當(dāng)沉默Rank后足細(xì)胞核內(nèi)的NFATc1的表達(dá)下調(diào)。這進(jìn)一步證實Rank介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能是通過正向調(diào)控NFATc1入核。

Ca2+內(nèi)流激活CaN去磷酸化NFATc1，促使NFATc1入核而介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，其中一個關(guān)鍵蛋白是足細(xì)胞膜上的通道蛋白TRPC6，TRPC6的活化程度決定了Ca2+內(nèi)流的量，影響CaN?NFAT的活化［10］。TRPC6調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流活化NFAT，同時活化的NFAT也增強TRPC6表達(dá)，形成正向反饋調(diào)節(jié)加劇足細(xì)胞損傷［23］。Rank是I型膜蛋白［15］，是否與足細(xì)胞膜通道蛋白TRPC6存在關(guān)聯(lián)，從而通過TRPC6?NFAT信號通路調(diào)節(jié)足細(xì)胞損傷。本研究在沉默Rank表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)TRPC6蛋白表達(dá)也減少，Rank和TRPC6之間存在正向關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步通過Co?IP實驗發(fā)現(xiàn)Rank能結(jié)合TRPC6，且Ionomycin刺激能增強Rank?TRPC6的結(jié)合。這些結(jié)果證實：Rank通過Rank/TRPC6/NFATc1信號通路介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)了一條新的足細(xì)胞損傷機(jī)制：Rank/TRPC6/NFATc1信號通路，闡明了Rank介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制，從新的角度豐富了CaN?NFAT信號通路。但Rank是如何影響足細(xì)胞標(biāo)記Podocin的表達(dá)改變，Rank介導(dǎo)足細(xì)胞損傷除了Rank/TRPC6/NFATc1是否還存在其他信號通路，后續(xù)筆者將繼續(xù)探究相關(guān)問題，并在動物體內(nèi)進(jìn)一步證實Rank/TRPC6/NFATc1信號通路對足細(xì)胞的損傷效應(yīng)，為臨床治療腎小球疾病提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。