高 霞，曹立偉，熊善柏,2，胡 楊,2，尤 娟,2，劉 茹,2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

肌球蛋白是肌纖維蛋白的重要組成部分，也是魚(yú)糜形成凝膠最重要的功能性蛋白[1-2]，肌球蛋白在體外很不穩(wěn)定，會(huì)迅速組裝成微絲，呈現(xiàn)出高度有序的組裝特性[3]。組裝體的尺寸和形態(tài)受自組裝條件的影響，比如蛋白濃度、溫度[4-5]、pH值、鹽濃度[6]、鹽的種類[7]和溶劑類型等[8]。因此，可通過(guò)控制自組裝條件來(lái)制備不同的肌球蛋白組裝體，進(jìn)而設(shè)計(jì)成不同性能的產(chǎn)品。肌球蛋白大分子的自組裝需要一定的濃度，濃度較低時(shí)，自組裝不能進(jìn)行[9]。隨蛋白濃度增加，蛋白分子的疏水性區(qū)域相互接觸，促使蛋白分子間相互作用[10]，大分子自組裝，進(jìn)而絮凝、成膠甚至形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[11]。且隨蛋白濃度增加，蛋白凝膠的強(qiáng)度會(huì)提高[12-13]。此外，Adam等[14]研究了幾種不同濃度的大分子溶液（極稀溶液、稀溶液、高濃度溶液），證明這些大分子間的交聯(lián)依次呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。魚(yú)糜加工過(guò)程中，低溫下初加工需較長(zhǎng)的時(shí)間，低溫下肌球蛋白低聚物會(huì)自組裝成簇，影響魚(yú)糜的凝膠特性[15-16]，二段式加熱有利于魚(yú)糜形成高彈性和持水性的凝膠體[17]。目前大多數(shù)研究集中于較高溫度下肌球蛋白分子的組裝和成膠[18-19]，對(duì)低溫下肌球蛋白自組裝的濃度效應(yīng)鮮見(jiàn)報(bào)道。研究肌球蛋白低溫自組裝動(dòng)力學(xué)及理化性能，不僅能為提高自組裝能力提供新的切入點(diǎn)，還可為減少肌球蛋白在熱膠凝前不期望的自組裝，提高其熱凝膠性能提供參考。

本實(shí)驗(yàn)以鰱魚(yú)肉為原料提取肌球蛋白，采用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察肌球蛋白組裝體的微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)研究不同質(zhì)量濃度肌球蛋白在低溫自組裝過(guò)程中蛋白質(zhì)構(gòu)象和分子間作用，以及組裝體的濁度和粒徑的變化，來(lái)探討低溫下肌球蛋白在不同質(zhì)量濃度下自組裝的特點(diǎn)，獲得不同質(zhì)量濃度肌球蛋白低溫自組裝動(dòng)力學(xué)方程，并對(duì)組裝體的流變學(xué)性能進(jìn)行分析，以期為拓寬魚(yú)蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域、提高魚(yú)蛋白的膠凝特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱（Hypophthalmichthyx molitrix），個(gè)體質(zhì)量約為1.5 kg，購(gòu)自華中農(nóng)大菜市場(chǎng)，將活鰱魚(yú)迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，宰殺取背脊部肉，暫時(shí)不用的置于4 ℃冰箱里保存，所用實(shí)驗(yàn)原料均是當(dāng)天的新鮮魚(yú)肉。

牛血清白蛋白（分析純） 武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；羅丹明B染料（分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（純度≥99.0%）、疊氮鈉（NaN3）（高級(jí)純） 美國(guó)Amresco公司；其他均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1750型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；722 N型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；ZEN 3600激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；AR 2000 ex流變儀 英國(guó)TA公司；LSM 510 META CLSM德國(guó)Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Cao Liwei等[20]的方法提取肌球蛋白，尸僵前的鰱魚(yú)背脊肉用食品調(diào)理機(jī)絞碎，向絞碎后的魚(yú)肉中加入10 倍體積含0.1 mol/L KCl、0.2 mg/mL NaN3和20 mmol/L Tris-HCl的緩沖液（pH 7.5），并用高速分散均質(zhì)機(jī)于9 000 r/min下均質(zhì)1～2 min。均質(zhì)液于4 ℃下放置15 min，8 000 r/min離心5 min后去除上清液，將沉淀于5 倍體積0.45 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8，含5 mmol/L β-ME、0.2 mol/L Mg2CO3、1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸）中懸浮，同時(shí)加入ATP-Na2使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白解離，ATPNa2的終濃度控制為5 mmol/L。于4 ℃下放置60 min后10 000 r/min 離心10 min，上清液用6 倍體積1 mmol/L KHCO3稀釋，于4 ℃下放置60 min，然后12 000 r/min 離心10 min。沉淀重新用2.5 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含0.5 mol/L KCl、5 mmol/L β-ME）懸浮，于4 ℃下放置15 min，再用2.5 倍體積的1 mmol/L KHCO3稀釋，并加MgCl2固體粉末至終濃度為10 mmol/L，于4 ℃下放置過(guò)夜，然后12 000 r/min離心15 min收集沉淀，得到純化的肌球蛋白。肌球蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定參考Lowry法[21]，用牛血清白蛋白作標(biāo)曲。純度采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）來(lái)檢驗(yàn)。

1.3.2 樣品處理與制備

用0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）將肌球蛋白的質(zhì)量濃度分別調(diào)整至0.1、0.3、0.5、1.0、5.0 mg/mL和8.0 mg/mL，分別于4 ℃下靜置2、12、24、36 h，取樣，測(cè)定相應(yīng)的理化指標(biāo)，其中，5.0 mg/mL和8.0 mg/mL樣品僅用于靜態(tài)流變學(xué)測(cè)定和CLSM觀察。

1.3.3 紫外吸收光譜測(cè)定

以0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）為參比空白，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在230～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行中速掃描，采樣間隔1 nm。利用Origin 8.0軟件作圖。

1.3.4 濁度測(cè)定

濁度的測(cè)定參考Yongsawatdigul等[22]的方法，以溶液320 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A320nm）來(lái)表示蛋白質(zhì)溶液的濁度。

1.3.5 動(dòng)態(tài)光散射表征粒徑大小

參考Zhan Fuchao等[23]的方法，采用激光粒度儀測(cè)定樣品的平均粒徑及粒徑分布。水溶劑黏度0.8873 mPa·s、介質(zhì)折射率1.33、物質(zhì)折射率1.45，相關(guān)測(cè)量時(shí)間函數(shù)通過(guò)自動(dòng)程序分析，平均粒徑由電腦自動(dòng)輸出。吸取2 mL樣液置于“聚苯乙烯”樣品池中，放入儀器中于25 ℃下進(jìn)行測(cè)試（散射角度173°）。每個(gè)樣品測(cè)試3 次，每次測(cè)試激光掃描15 圈。

采用一階模型[24]（式（1））對(duì)組裝體的平均粒徑數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

式中：Z表示t時(shí)刻的平均粒徑/nm；Z0表示初始平均粒徑/nm；k表示組裝速率/h－1；t表示組裝時(shí)間/h。

1.3.6 靜態(tài)流變學(xué)性能測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)流變儀在flow模式下掃描，測(cè)試條件為：溫度4 ℃、錐板（2°）直徑40 mm、載物臺(tái)與平板間距54 μm。數(shù)據(jù)獲取模式為Continuous step，以剪切速率（γ）為變量，變量范圍為0.1～1000 s－1，得到剪切應(yīng)力（τ）隨剪切速率變化曲線，采用冪律定律（式（2））擬合τ-γ曲線。

式中：τ表示剪切應(yīng)力/Pa；K表示稠度系數(shù)/（Pa·sn）；γ表示剪切速率/s－1；n表示流動(dòng)指數(shù)。

表觀黏度（ηa/（Pa·s））可由式（3）計(jì)算獲得。

采用Cross模型（式（4））擬合其零剪切黏度（η0）。

式中：η∞表示無(wú)窮剪切黏度/（Pa·s）；η0表示零剪切黏度/（Pa·s）；α表示Cross模型參數(shù)。

1.3.7 CLSM分析

采用CLSM觀察肌球蛋白組裝體（組裝12 h）的立體顯微結(jié)構(gòu)及在溶液中的分布狀況。使用羅丹明B對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，磁力攪拌后得到均勻樣品，待測(cè)。標(biāo)記量為每50 mL樣液加入體積分?jǐn)?shù)0.2%羅丹明B 100 μL。取適量的樣品于顯微鏡長(zhǎng)蓋玻片上，使用10×目鏡和100×物鏡觀測(cè)，選用熒光模式。采用He/Ne激光器作為激發(fā)光源，發(fā)射波長(zhǎng)確定為543 nm，使用光電倍增管進(jìn)行熒光檢測(cè)。掃描密度為1 024×1 024，掃描頻率為40 Hz。參數(shù)確定后進(jìn)行掃描，采集液滴圖像。儀器平均多次掃描信號(hào)的波動(dòng)，以減少對(duì)激光共聚焦圖片的影響。實(shí)驗(yàn)在25 ℃空調(diào)房間內(nèi)避光測(cè)量。用儀器自帶的LSM Image Examiner軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0軟件作圖，SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用ANOVA進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗(yàn)方法為最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，P＜0.05表示差異顯著。有關(guān)數(shù)據(jù)為3 次以上平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚(yú)肌球蛋白純度鑒定

圖1 提取的肌球蛋白的SDS-PAGE譜圖（a）和各條帶所占比例（b）Fig.1 SDS-PAGE patterns of the extracted myosin （a） and the percentage of each band in SDS-PAGE pattern （b）

提取的鰱肌球蛋白的SDS-PAGE圖見(jiàn)圖1a，肌球蛋白重鏈的分子質(zhì)量為223 kDa，肌球蛋白輕鏈的分子質(zhì)量為21、14 kDa，這與之前學(xué)者報(bào)道的肌球蛋白分子由2 條分子質(zhì)量各為220 kDa的重鏈和4 條分子質(zhì)量在17～22 kDa范圍的輕鏈所組成[25]是基本一致的。圖1a中幾乎看不出肌動(dòng)蛋白的條帶（43 kDa），在70 kDa處有含量甚微的原肌球蛋白帶。肌球蛋白具有物種差異性，且不同魚(yú)種之間也有差別，尤其體現(xiàn)在輕鏈上。通過(guò)Gel-pro analyzer 4.0凝膠定量分析軟件計(jì)算得出各條帶的比例分布。由圖1b可知，肌球蛋白重鏈在整個(gè)泳道所有條帶中所占比例達(dá)75%，同時(shí)也計(jì)算得出肌球蛋白的純度達(dá)92%，說(shuō)明所得肌球蛋白的純度高，可作為本實(shí)驗(yàn)原料使用。

2.2 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白低溫放置過(guò)程中的紫外吸收光譜

圖2 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白溶液低溫放置過(guò)程中的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of myosin assembly suspension under the condition with different concentrations

紫外吸收光譜是一種研究蛋白構(gòu)象的有效手段[26]。由圖2可以看出，肌球蛋白溶液在276 nm波長(zhǎng)處有明顯的吸收峰，表明有色氨酸、酪氨酸等疏水性氨基酸殘基的存在[27]，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，該吸光度呈增大趨勢(shì)，說(shuō)明肌球蛋白分子鏈逐漸伸展，暴露出更多的疏水性殘基。320～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度也隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，結(jié)合276 nm處吸光度的變化，推測(cè)放置過(guò)程中肌球蛋白分子伸展暴露出更多的活性基團(tuán)，有利于分子間相互作用，形成了大的組裝體，增加了光散射強(qiáng)度。Brenner等[15]曾報(bào)道了類似的現(xiàn)象，鱈魚(yú)肌球蛋白在低溫條件下也會(huì)自發(fā)組裝形成寡聚體。隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，吸光度呈增加趨勢(shì)，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，質(zhì)量濃度高的肌球蛋白樣品吸光度增大的幅度更大。

2.3 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白低溫放置過(guò)程中的濁度變化

圖3 不同質(zhì)量濃度下肌球蛋白低溫放置過(guò)程中的濁度變化Fig.3 Turbidity of myosin suspension at different concentrations

濁度可用于反映蛋白質(zhì)的組裝情況。由圖3可知，0.1、0.3 mg/mL的肌球蛋白樣品在放置的前24 h，其濁度隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增大，24 h后濁度緩慢增大但無(wú)顯著變化。濁度增大可能是由于肌球蛋白自組裝形成了大的組裝體[2,28]，有研究報(bào)道，低溫下肌球蛋白分子間主要依靠氫鍵、靜電相互作用等組裝形成微粗絲[6]。隨后肌球蛋白以微粗絲為“成核中心”，繼續(xù)組裝形成更大尺寸的粗絲，濁度進(jìn)一步增大，24 h以后肌球蛋白的自組裝基本達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。0.5、1.0 mg/mL肌球蛋白樣品的濁度隨著放置時(shí)間（0～36 h）的延長(zhǎng)而顯著增大（P＜0.05），說(shuō)明在放置時(shí)間（36 h）內(nèi)肌球蛋白自組裝持續(xù)進(jìn)行。肌球蛋白的自組裝行為是一個(gè)有序排列的過(guò)程，質(zhì)量濃度越大，混亂度也越大，達(dá)到有序結(jié)構(gòu)的時(shí)間也相對(duì)越長(zhǎng)。

2.4 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白低溫放置過(guò)程中的粒徑變化

為進(jìn)一步了解肌球蛋白組裝體的尺寸大小和穩(wěn)定性，采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定了肌球蛋白在組裝過(guò)程中的粒徑分布及平均粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4a可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)（2～36 h）和蛋白質(zhì)量濃度的增加（0.1～1.0 mg/mL），肌球蛋白組裝體的粒徑分布均向大粒徑方向移動(dòng)，說(shuō)明自組裝在進(jìn)行，且肌球蛋白質(zhì)量濃度越大，形成的組裝體越大。由圖4b可知，0.1 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑在2～12 h之間隨放置時(shí)間延長(zhǎng)顯著增大（P＜0.05），繼續(xù)延長(zhǎng)自組裝時(shí)間（12～36 h）對(duì)平均粒徑的影響不顯著（P＞0.05），說(shuō)明低質(zhì)量濃度肌球蛋白自組裝能較快達(dá)到平衡。0.3 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑在2～12 h之間顯著增大（P＜0.05），但在12～24 h間增長(zhǎng)不顯著（P＞0.05），繼續(xù)延長(zhǎng)自組裝時(shí)間（24～36 h），平均粒徑又顯著增大。0.5、1.0 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑隨著自組裝時(shí)間（2～36 h）的延長(zhǎng)一直呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），說(shuō)明提高蛋白質(zhì)量濃度后自組裝平衡所需的時(shí)間也隨之延長(zhǎng)，各質(zhì)量濃度下肌球蛋白樣品的自組裝可劃分為成核、組裝、平衡3個(gè)階段。該結(jié)果與濁度結(jié)果基本一致。

圖1 不同質(zhì)量濃度下肌球蛋白組裝體的粒徑分布（a）及平均粒徑（b）Fig.1 Particle sizes （a） and Z-average particle sizes （b） of myosin assemblies at different concentrations

為進(jìn)一步探究肌球蛋白組裝動(dòng)力學(xué)，采用一階模型對(duì)其平均粒徑進(jìn)行擬合，方程P值均小于0.05，說(shuō)明該模型具有較高的擬合精度，所得動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。隨著蛋白質(zhì)量濃度增大（0.1～1.0 mg/mL），肌球蛋白樣品的初始平均粒徑（Z0）呈上升趨勢(shì)，即質(zhì)量濃度越高，初始組裝體越大。肌球蛋白質(zhì)量濃度較低（0.1～0.3 mg/mL）時(shí)，組裝速率k值較接近，當(dāng)肌球蛋白質(zhì)量濃度由0.3 mg/mL增至1.0 mg/mL時(shí)，組裝速率迅速增大，說(shuō)明肌球蛋白在低質(zhì)量濃度時(shí)組裝速率慢；當(dāng)質(zhì)量濃度提高至0.5 mg/mL以上時(shí)，肌球蛋白之間相互接觸的幾率更大，暴露出的活性基團(tuán)更易發(fā)生相互作用，組裝速率加快，分子以微粗絲為成核中心，繼續(xù)組裝成為更大的組裝體。

表1 低溫下肌球蛋白自組裝的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Kinetic parameters for myosin self-assembly at low temperature

根據(jù)表1中得到的參數(shù)，進(jìn)一步對(duì)組裝速率k與質(zhì)量濃度ρ進(jìn)行擬合，可用線性方程很好地描述兩者之間的關(guān)系。因此，將質(zhì)量濃度作為動(dòng)力學(xué)方程的自變量之一，重新擬合得到的方程為：（P＜0.000 1），說(shuō)明該方程可以很好地描述不同質(zhì)量濃度肌球蛋白在低溫自組裝過(guò)程中粒徑隨時(shí)間的變化。且通過(guò)該方程可更直觀地看出，速率常數(shù)隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大，表明質(zhì)量濃度較高時(shí)組裝體粒徑增大的速度加快。

2.5 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白在低溫放置過(guò)程中流變學(xué)特性

圖5為自組裝12 h肌球蛋白樣品的剪切應(yīng)力τ隨剪切速率γ的變化（其他放置時(shí)間下趨勢(shì)類似，故省略）。溶液的剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增加而增大，在低剪切速率下，剪切應(yīng)力隨剪切速率的增長(zhǎng)呈近似直線增長(zhǎng)的趨勢(shì)，表現(xiàn)出牛頓流體的性能，此階段流體的黏性表征為零剪切黏度（η0），不受剪切速率的影響。利用Cross模型擬合所得η0見(jiàn)表2，對(duì)于低質(zhì)量濃度（0.1～0.3 mg/mL）的肌球蛋白樣品而言，延長(zhǎng)放置時(shí)間，η0很小且沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明低質(zhì)量濃度時(shí)肌球蛋白相對(duì)穩(wěn)定，分子間相互作用較弱，流動(dòng)性強(qiáng)。對(duì)于質(zhì)量濃度為0.5～8.0 mg/mL的肌球蛋白，隨著自組裝時(shí)間從2 h延長(zhǎng)至24 h，η0逐漸增大，表明肌球蛋白分子間相互作用增強(qiáng)，形成了具有一定結(jié)構(gòu)的組裝體，流動(dòng)性下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肌球蛋白自組裝需要一定的質(zhì)量濃度（不低于0.5 mg/mL），達(dá)到該質(zhì)量濃度分子鏈間相互交聯(lián)和纏結(jié)形成組裝體。

圖5 自組裝12 h下肌球蛋白溶液的τ-γ曲線Fig.5 τ-γ curves of silver carp myosin at the self-assembly time of12 h

表2 不同自組裝時(shí)間下肌球蛋白溶液的η0Table2 Parameter η0of myosin suspension at different self-assembly time Pa·s

在22～220 s－1剪切速率范圍內(nèi)，肌球蛋白組裝體部分解體，分子鏈段隨流動(dòng)方向拉伸、取向，剪切應(yīng)力與剪切速率不能維持正比關(guān)系，偏離直線變成向下彎曲的曲線（圖5），表現(xiàn)出剪切稀化行為，采用冪律定律進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表3。所得模型P值均小于0.01，說(shuō)明具有較高的擬合精度，所有肌球蛋白溶液的n值均小于1，表現(xiàn)為假塑性流體。隨著自組裝時(shí)間（2～36 h）的延長(zhǎng)，質(zhì)量濃度為0.5～8.0 mg/mL的肌球蛋白所形成的組裝體的n值逐漸降低，K值逐漸增大；同樣，隨著蛋白質(zhì)量濃度增加，n值也下降，說(shuō)明溶液的假塑性增強(qiáng)，推測(cè)這是由于肌球蛋白分子間發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致所形成組裝體的尺寸逐漸增大而流動(dòng)性降低。這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究魚(yú)肉與豬肉肌動(dòng)球蛋白靜態(tài)流變學(xué)性能的結(jié)果一致，肌動(dòng)球蛋白質(zhì)量濃度增大也會(huì)使其假塑性增強(qiáng)，降低其流動(dòng)性[29]。

表3 不同自組裝時(shí)間下肌球蛋白溶液的稠度系數(shù)（K）和流動(dòng)指數(shù)（n）Table3 Consistency coef fi cients （K） and fl ow indices （n） for myosin suspension at different self-assembly time

圖6 不同組裝時(shí)間下肌球蛋白表觀黏度（ηa）與剪切速率（γ）的關(guān)系Fig.6 Relationship between apparent viscosity （ηa） of myosin and shear rate （γ） at different self-assembly time

由圖6可知，所有樣品的ηa都隨著γ增大先迅速下降后緩慢下降至趨于穩(wěn)定，這種趨勢(shì)在較高質(zhì)量濃度（1.0～8.0 mg/mL）下更直觀，推測(cè)較高質(zhì)量濃度下形成的肌球蛋白組裝體具有相互纏繞和交聯(lián)的長(zhǎng)分子鏈結(jié)構(gòu)，在靜止時(shí)將保持其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性，因而具有較高的內(nèi)部阻力阻礙流動(dòng)，表現(xiàn)為較高的黏度；低剪切速率下，盡管有輕微的剪切取向效應(yīng)，但分子的無(wú)規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)使所有的分子或分子組裝體都處于無(wú)序狀態(tài)。隨著γ的增大，肌球蛋白溶液將沿著剪切驅(qū)動(dòng)力的方向流動(dòng)，部分組裝體解體，分子鏈逐漸解纏繞、拉伸和取向，排列后的分子或分子組裝體更容易相互滑移，溶液的ηa急劇下降[30]。當(dāng)γ增大到一定程度，ηa趨于穩(wěn)定，即表現(xiàn)出類似牛頓流體的性能。

2.6 不同質(zhì)量濃度肌球蛋白低溫放置過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)

圖7 肌球蛋白組裝體的CLSM圖（×1 000）Fig.7 CLSM images of myosin assemblies （ × 1 000）

圖7 為低溫下肌球蛋白溶液組裝12 h后的CLSM圖。組裝體的尺寸隨蛋白質(zhì)量濃度增加而增大；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1、0.3 mg/mL時(shí)，溶液中可以觀察到極少量肌球蛋白的存在；質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的肌球蛋白經(jīng)過(guò)自組裝后形成了均一分散在溶液中的小聚集體（粒徑＜20 μm）。這是由于低質(zhì)量濃度下肌球蛋白分子間的距離較大，分子間自組裝行為不易進(jìn)行且組裝速率較低；隨著蛋白質(zhì)量濃度增大（大于等于0.5 mg/mL時(shí)），肌球蛋白自組裝速率提高，甚至組裝成肉眼可見(jiàn)的粗絲（5.0、8.0 mg/mL）。綜上分析可知，肌球蛋白低溫快速自組裝的臨界質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，這與膠原蛋白自組裝的臨界質(zhì)量濃度在0.30～0.45 mg/mL之間相近[31]。

3 結(jié) 論

低溫（4 ℃）放置過(guò)程中肌球蛋白的自組裝行為表現(xiàn)出較強(qiáng)的質(zhì)量濃度依賴性。隨自組裝時(shí)間的延長(zhǎng)和蛋白質(zhì)量濃度增大，分子間相互作用加強(qiáng)，初步聚集成微絲并繼續(xù)以其為成核中心組裝成更大的組裝體，使得肌球蛋白溶液在230～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度和濁度增大；動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)組裝體粒徑的變化可由動(dòng)力學(xué)模型

較好地描述，當(dāng)質(zhì)量濃度提高到0.5 mg/mL時(shí)，肌球蛋白溶液的組裝速率加快；隨著肌球蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大，組裝平衡時(shí)間也延長(zhǎng)。進(jìn)一步用靜態(tài)流變學(xué)表征樣品的性能變化發(fā)現(xiàn)，各質(zhì)量濃度肌球蛋白溶液都呈現(xiàn)出典型的剪切稀化行為，隨蛋白質(zhì)量濃度提高，肌球蛋白組裝體對(duì)溶液流動(dòng)的阻礙作用增強(qiáng)，表觀黏度隨剪切速率增大而降低；CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL時(shí)溶液所形成的組裝體尺寸較小且分布均勻，再提高質(zhì)量濃度便能形成肉眼可見(jiàn)的粗絲。綜上結(jié)果推測(cè)肌球蛋白快速自組裝的臨界質(zhì)量濃度是0.5 mg/mL。