程穎 劉軍 李昱 劉翟 任翔 施一 高福 余宏杰

埃博拉病毒?。‥bola Virus Disease）以往稱埃博拉出血熱（Ebola Hemorrhagic Fever）。目前國內統(tǒng)稱為埃博拉出血熱，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和美國疾病預防控制中心（Centersfor Disease Control and Prevention，US CDC）已將埃博拉出血熱更名為埃博拉病毒病。該病是埃博拉病毒（Ebolavirus）感染所致的一種急性傳染病，病死率可高達90%，是病死率最高的傳染病之一。2013年12月，地處西非的幾內亞開始出現(xiàn)埃博拉病毒病暴發(fā)疫情，隨后在利比里亞、塞拉利昂和尼日利亞等西非國家相繼暴發(fā)。截至2014年8月15日，上述西非4國已報告2127例埃博拉病毒病病例，死亡1145人。2014年8月8日，世界衛(wèi)生組織宣布西非埃博拉病毒病疫情為“國際公共衛(wèi)生緊急事件”，進一步引起了國內外媒體和公眾的廣泛關注。我國與西非國家在勞務、商務、留學教育等領域合作緊密，相關人員往來密切，還有援外醫(yī)療隊常駐西非國家，雖然尚無確認埃博拉疫情，但隨時面臨輸入風險。為加深對該病的科學認識和應對準備，現(xiàn)對其病原學特征、致病機制、治療和疫苗研究進展進行綜述。

1 病原學特征

1.1 形態(tài)

埃博拉病毒屬與馬爾堡病毒屬和Cuevavirus 屬同歸為絲狀病毒科。埃博拉病毒為單股負鏈、不分節(jié)段、有囊膜的RNA 病毒，于1976年被首次分離。在電子顯微鏡下，該病毒一般呈現(xiàn)線形結構，也可能出現(xiàn)“U”字、“6”字形、纏繞、環(huán)狀或分枝狀等多種形態(tài)。病毒直徑80 nm 左右，但長度變化很大，一般為1000 nm，最長可達14000 nm，病毒基因組大小約19 kb。

1.2 基因組

成熟的病毒體由位于中心的核衣殼（Nucleocapsid）和外面的囊膜（Envelope）構成。核衣殼與囊膜之間的區(qū)域，稱為基質空間，由病毒蛋白VP40 和VP24 組成。位于病毒體中心的核衣殼蛋白由螺旋狀纏繞的負鏈核糖核酸與核蛋白（NP）、病毒蛋白VP35 和VP30、RNA 依賴的RNA 聚合酶（L）組成。病毒囊膜來自宿主的細胞膜，糖蛋白（GP）為跨膜蛋白，形成三聚體刺突，包含由二硫鍵鏈接的糖蛋白1 和糖蛋白2 兩個堿性蛋白酶裂解片段。

埃博拉病毒基因組編碼7個結構蛋白和2個非結構蛋白。基因順序為3′端-NP-VP35-VP40-GP-VP30- VP24-L-5′端，兩端的非編碼區(qū)含有重要的信號以調節(jié)病毒轉錄、復制和新病毒顆粒包裝。除編碼糖蛋白的基因外，所有基因均為一個單順反子，編碼一個結構蛋白?；蚪M所編譯的蛋白中，NP 是核衣殼蛋白，VP30 和VP35 是病毒結構蛋白，VP35 具有拮抗 Ⅰ 型干擾素作用，GP是跨膜糖蛋白，與病毒的入侵過程及細胞毒性有關，VP24 和VP40 與病毒的成熟釋放有關，前者是小型膜蛋白，后者構成病毒基質蛋白。RNA 依賴的RNA 聚合酶（L），是病毒基因組轉錄成信使RNA 所必需的酶，它對病毒基因組的復制也有重要作用。另外，可溶性的糖蛋白（sGP）和小可溶性糖蛋白（ssGP）與跨膜GP 約有300個氨基酸相同，大小分別為60～70 kD 和全長度的150～170 kD，經(jīng)過相同基因轉錄編輯過程，sGP 和ssGP 與埃博拉病毒細胞毒性有關。

1.3 分型與變異

埃博拉病毒病一直被認為是動物源性傳染病，但其在自然界確切的傳播和循環(huán)方式尚不清楚?，F(xiàn)有證據(jù)支持的假說認為，埃博拉病毒通過其自然儲存宿主果蝠傳給大猩猩、黑猩猩等非人類靈長類動物，果蝠和這些靈長類動物均可將埃博拉病毒傳給人，然后病毒在人與人之間傳播，最終引起人群中暴發(fā)流行。目前，確認埃博拉病毒屬包括5個種：扎伊爾型（Za?re ebolavirus，EBOV）、蘇丹型（Sudanebolavirus，EBOV）、塔伊森林型（Ta? Forest ebolavirus，TAFV，又叫科特迪瓦型或象牙海岸型）、本迪布焦型（Bundibugyoe ebolavirus，BDBV，又叫烏干達型）和萊斯頓型（Reston ebolavirus，RESTV）。前4 種埃博拉病毒都有感染人類并導致類似臨床癥狀的報道，目前僅在非洲發(fā)現(xiàn)。它們的毒力不同，所致疾病的病程進展也各不相同，病死率約為25%～90%。其中，扎伊爾型對人致病性最強，蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林型，對黑猩猩致病性強，對人較弱。萊斯頓型曾在菲律賓的獼猴暴發(fā)疫情中發(fā)現(xiàn)，也曾在美國和意大利從菲律賓進口的獼猴中發(fā)現(xiàn)，2008年首次在菲律賓的豬中分離到該型病毒。萊斯頓型可以感染人類，但至今尚無引起疾病或死亡的報道。2011年我國曾在豬中檢出萊斯頓型病毒RNA，但缺乏病毒分離的結果。

埃博拉病毒的進化速率約為7×10–4突變位點–1年–1。1976年發(fā)現(xiàn)扎伊爾型埃博拉病毒以來，埃博拉病毒40年里積累了大量的突變。目前已發(fā)現(xiàn)的EBOV 病毒株都是1976年的毒株突變而來。但是全基因組測序分析顯示，此次西非疫情的幾內亞毒株與已發(fā)現(xiàn)的剛果EBOV 病毒株的同源性只有97%，并形成獨立進化支，該毒株與剛果和加蓬EBOV 型平行進化，源自共同祖先，并非由其他兩國傳入幾內亞。然而，仍有德國科學家認為此次暴發(fā)疫情的病毒株可能來源于中非。

1.4 抵抗力

埃博拉病毒對熱有中度抵抗力，在室溫及4℃存放1個月后，感染性無明顯變化，但在60℃條件下60 min 可被殺死。還可以通過紫外線、γ 射線、煮沸滅活5 min 等方式滅活病毒。同時，該病毒還對次氯酸鈉和消毒劑敏感，但冰凍或冷藏無法滅活病毒。

2 致病機制

埃博拉病毒屬生物安全級別最高的A 類病原，對活病毒的操作需要在生物安全4 級實驗室進行，包括實驗動物接種、細胞培養(yǎng)、病毒分離等。埃博拉病毒的主要靶細胞是血管內皮細胞、肝細胞、巨噬細胞等，通過抑制天然和獲得性免疫應答反應，增加血管通透性，引起肝臟為代表的多臟器損傷，引發(fā)嚴重的發(fā)熱、出血、休克、多器官功能衰竭等癥狀，重者可致死亡。

2.1 病毒感染靶細胞和組織

埃博拉病毒感染機體后，通過刺突糖蛋白與宿主細胞膜表面的受體結合進入細胞。原位雜交和電子顯微鏡顯示，單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、肝細胞、腎上腺細胞，以及多種上皮細胞對病毒復制起重要作用。其中單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞是早期被感染的細胞和主要的病毒復制場所，進而使病毒由感染部位進入淋巴結、肝臟和脾臟等器官。病毒對靶細胞的感染具體包括，（ⅰ）受到感染的單核細胞和巨噬細胞釋放多種細胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1β（IL-1β）、活性氧和一氧化氮等，引起單核細胞和巨噬細胞的聚集，并激活中性粒細胞，進一步擴大炎癥反應。同時，受到感染的單核細胞和巨噬細胞表達多種與凝血功能異常密切相關的細胞因子。因此，單核細胞和巨噬細胞不僅無法清除埃博拉病毒，反而協(xié)助病毒增殖，并將病毒轉運、擴散至宿主全身。（ⅱ）埃博拉病毒可在重要的抗原呈遞細胞（APC），如樹突狀細胞（DC）內完成增殖。（ⅲ）通過糖蛋白或病毒感染，可直接破壞細胞結構，損傷肝、腎上腺皮質、脾臟等組織器官。人類和非人靈長類動物感染后，肝臟出現(xiàn)不同程度灶狀壞死，引發(fā)凝血功能障礙；腎上腺皮質細胞壞死，導致血管血壓調節(jié)障礙。

2.2 免疫應答反應受到抑制

包括天然免疫及獲得性免疫應答均受到抑制，（?。┨烊幻庖邞?，如干擾素產(chǎn)生受到抑制。病毒蛋白VP24 中止了蛋白信號轉導和活化因子1（STAT1）在細胞核內積聚過程，通過阻止I 型干擾素的信號抑制干擾素產(chǎn)生；病毒蛋白VP35 通過阻斷干擾素調節(jié)因子3（IRF-3）的活性，降低干擾素的作用，使周圍的正常細胞失去保護。（ⅱ）獲得性免疫應答的多個環(huán)節(jié)受到抑制：（1）樹突狀細胞作為重要的抗原呈遞細胞，處于機體天然免疫和獲得性免疫防御病原體的核心環(huán)節(jié)。體外實驗表明，埃博拉病毒感染后的髓系樹突狀細胞將無法釋放集落刺激因子等細胞因子，不能發(fā)育成熟，從而無法上調主要組織相容性復合物（MHC）分子的表達，激活淋巴細胞。樹突狀細胞功能的異常，意味著無法正常激活重要的體液和細胞免疫應答過程；（2）通過TRAIL 和Fas-FasL 途徑，引起大量淋巴細胞凋亡，導致CD4＋和CD8＋T 細胞的銳減。獼猴感染病例的研究顯示，病毒主要導致體內T 細胞和NK 細胞凋亡。淋巴細胞凋亡，部分解釋了死亡病例進展性的淋巴細胞減少和淋巴耗竭。2000年烏干達埃博拉疫情暴發(fā)時，重癥病例出現(xiàn)循環(huán)T淋巴細胞減少，但幸存者淋巴細胞數(shù)量未見明顯減少。另外，可溶性介質（如NO 等）的非正常產(chǎn)生，病毒糖蛋白C 末端免疫抑制性基序的識別或直接介導淋巴細胞功能破壞或細胞減少。（ⅲ）胸腺、淋巴結和脾臟等重要免疫器官，出現(xiàn)耗竭和壞死，而炎癥細胞少見。

對比感染埃博拉病毒后康復者和病情惡化者的臨床表現(xiàn)和免疫反應發(fā)現(xiàn)，抗原特異性細胞介導的免疫反應的發(fā)展和病毒的清除成正相關。然而，給感染埃博拉病毒的獼猴被動輸注埃博拉病毒人源中和性單克隆抗體KZ52，卻無法控制感染。因此，免疫球蛋白的保護作用尚不明確。但可以肯定的是，感染早期正常的、短暫的天然免疫應答，以及隨之激活的獲得性免疫應答，對于保護機體免受致命性感染是必需的。最近3 種單克隆抗體聯(lián)合使用的雞尾酒療法被證明有效。

2.3 血管損傷

關于血管內皮細胞損傷的分子機制尚待研究。現(xiàn)有研究顯示，糖蛋白是血管細胞損傷的重要因子，再加上病毒對內皮細胞結構的直接破壞，最終導致出血癥狀。但尸檢并未見明顯血管損傷。并且有研究顯示，內皮細胞感染偶然發(fā)現(xiàn)于食蟹猴病毒感染的晚期。血小板減少癥、凝血因子消耗和纖維蛋白降解產(chǎn)物滴度增加，是埃博拉病毒感染后凝血病理表現(xiàn)。埃博拉病毒病中凝血異常與彌散性血管內凝血一致。因此，凝血因子合成下降以及肝功受損導致血漿蛋白異常與出血傾向有關。腎上腺皮質受損后，會導致低血壓和低血容量低鈉血癥。該癥狀幾乎見于所有感染者，并在出血晚期的休克過程中起重要作用。病毒感染后還引發(fā)眾多炎癥因子IL-2，6，8，10，天然抗凝蛋白C 等釋放，導致了疾病晚期出血和休克的發(fā)生。值得關注的是，NO 在非人靈長類動物感染扎伊爾型病毒，以及人類感染扎伊爾型和蘇丹型病毒后，滴度升高，并顯示與死亡相關。NO 不正常產(chǎn)生，與旁路淋巴細胞凋亡、組織損傷和血管缺乏完整性等眾多病理生理紊亂有關。另外，NO 也是重要的低血壓介質。

目前認為，APC 細胞的感染和激活是埃博拉病毒病發(fā)展的重要基礎。APC 細胞以及其他細胞釋放的炎癥促進因子、趨化因子和其他介質，造成血管和凝血系統(tǒng)的損傷，引發(fā)多器官功能衰竭以及類似中毒性休克的癥候群。

3 治療研究進展

3.1 抗病毒藥物

抗流感病毒藥物-法匹拉韋（favipiravir）（T-705，商品名Avigan）是針對埃博拉病毒病研究進展較快的抗病毒藥物。T-705 作為嘌呤類似物，可引發(fā)RNA 病毒復制過程紊亂，從而阻礙病毒增殖。實驗證實，T-705 還能抑制黃病毒科的西尼羅病毒、黃熱病毒和口蹄疫病毒等，因此，對于同屬RNA 病毒的埃博拉病毒可能有效。該藥已在日本批準上市用于治療流感，目前在美國通過了 Ⅱ期臨床試驗。廣譜抗病毒藥物BCX4430，屬于小分子的腺苷類似物，被整合進病毒RNA 復制過程后，使得病毒RNA 空間構型改變，從而嚴重影響后續(xù)轉錄、翻譯過程。BCX4430 對馬爾堡病毒和扎伊爾型埃博拉病毒效果明顯，目前該藥已經(jīng)進入臨床試驗階段。廣譜抗病毒藥物三氮唑核苷（ribavirin，利巴韋林），通過干擾病毒mRNA的帽化阻礙病毒復制，用于治療布尼亞等病毒引起的出血熱。由于缺乏針對絲狀病毒的體內、體外實驗數(shù)據(jù)，加上嚴重的副作用，不推薦利巴韋林用于治療埃博拉病毒病。

3.2 生物治療

目前針對埃博拉病毒病的治療主要是基于混合多種抗體的雞尾酒療法等生物治療和支持治療。其中ZMapp 是由美國與加拿大聯(lián)合研制的藥物，包含3 種人源化的單克隆抗體，通過植物細胞表達系統(tǒng)（煙草 屬）表達生產(chǎn)。屬于優(yōu)化的雞尾酒療法，包含針對埃博拉病毒感染有保護效果的單克隆抗體組合MB003和ZMAB 中最有效的成分。ZMapp 在非人類靈長類動物實驗中效果顯著，并且在兩位在西非感染埃博拉病毒的美國醫(yī)務人員和一位西班牙傳教士的治療中使用，其中2 名美國患者的臨床癥狀得以改善，西班牙患者死亡。然而，目前不能確定是否因為使用ZMapp 而使2 位美國患者康復，其安全性和有效性尚待進一步臨床試驗驗證。同時，ZMapp 的供應量有限，規(guī)?；a(chǎn)雖處于準備階段，仍需時間。此外，人鼠嵌合單克隆抗體（c13C6，h-13F6 和c6D8）的混合株MB-003，可以對恒河猴發(fā)揮有效的保護作用，但尚未在人類證實有效。

另外，TKM-Ebola 是一種基因治療藥物，屬siRNA，專門針對埃博拉病毒相關基因VP24 和VP35、RNA 依賴的RNA 聚合酶，通過RNA干擾，使得相關蛋白的RNA 被沉默封閉，達到阻止病毒增殖的目的。目前正處于臨床I期試驗。基于RNA的治療，目前主要針對扎伊爾型埃博拉病毒，在嚙齒類和非人類靈長類動物有效。該方法需要限定特定型別的埃博拉病毒，但暴發(fā)早期常無法確定病毒型別。另外，這類藥物主要經(jīng)靜脈給藥，對于偏遠地區(qū)的治療面臨物流的挑戰(zhàn)。輸注患者恢復期血漿提供中和抗體的治療，尚未取得滿意療效，或有助于減輕病毒載量，若結合其他治療方式，或許有效。

3.3 支持療法

在非人靈長類動物感染扎伊爾型埃博拉病毒的實驗中，使用源于絲蟲的抗凝蛋白rNAPc2，可提供33%的有效性。rNAPc2 主要作用于外源性凝血途徑。研究表明，活化蛋白C 在恒河猴中的保護作用與rNAPc2 一致。該類藥物已經(jīng)獲批用于臨床，可在應急處置時貯備。

4 疫苗研發(fā)進展

過去數(shù)10年，埃博拉疫情多次暴發(fā)流行，因僅限于非洲大陸，其疫苗研發(fā)速度受限。截至目前，尚無批準上市的疫苗。開展針對候選疫苗有效性的實驗，至少需要2個動物模型，其中1個必須為非人類靈長類動物模型。因此，目前少有候選疫苗能滿足此要求，進入臨床試驗階段。目前處于研發(fā)中的“有希望疫苗”主要分兩類：一類是復制缺陷型疫苗，安全性好，有些已在動物實驗和I期臨床試驗中顯示良好的效力和免疫原性，但誘導免疫的時間較長，適合暴露前預防使用；另一類是減毒復制型疫苗，存在一定的安全性隱患。例如，以皰疹性口炎病毒為載體的重組疫苗在靈長類動物實驗中表現(xiàn)良好，可用于暴發(fā)疫情處置和生物恐怖襲擊應對。隨疫苗研發(fā)技術改進，腺病毒Ad5 亞型載體疫苗攜有重組的扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白的復制缺陷疫苗，僅需一次免疫。當然，使用該類疫苗要區(qū)分病毒型別，因不同型別之間少有交叉反應。未來，至少包含3 種成分的多價絲狀病毒疫苗也有良好應用前景。同屬于該類疫苗的第2個研發(fā)方案是共表達基質蛋白VP40、核蛋白和糖蛋白的病毒樣顆粒。該方案有效克服疫苗安全隱患，但需佐劑和加強免疫，不適合在疫情應急處置中使用。另外，該疫苗的費用和生產(chǎn)存在一些挑戰(zhàn)，雖然可借反向遺傳技術緩解生產(chǎn)壓力，但會帶來新的安全隱患。

通常而言，減毒復制型疫苗比復制缺陷型疫苗引發(fā)免疫應答的效果更顯著，易于生產(chǎn)且能刺激天然和獲得性（體液和細胞）免疫應答。然而，該原則并不適用于埃博拉病毒，因為在確認活疫苗的安全性上有一定難度。減毒復制型疫苗是基于弱毒的病毒載體制備而成，如皰疹性口炎病毒、副流感病毒載體。盡管已在動物，包括免疫缺陷動物實驗中取得良好記錄，但這些疫苗均存在安全隱患。對于腺病毒載體，采用人副流感病毒的方法或許存在預存免疫的問題。目前對抗體反應、T 細胞增殖、細胞毒性T 細胞研究顯示，抗體和輔助性T 細胞記憶是介導保護性免疫應答必要的；細胞介導的免疫應答盡管重要，但并非必需。針對幾種疫苗的臨床前評價也在進行中，由美國NIH 支持的一種疫苗，正在等待FDA 進入臨床實驗的審批，有望在2014 秋天進入I期臨床試驗。該腺病毒載體疫苗，包含2個埃博拉病毒糖蛋白插入基因片段，已開展了黑猩猩動物實驗。另外2 種包含皰疹性口炎病毒假型病毒的疫苗，其中一種候選疫苗的臨床試驗，將于2015年早期進行。

5 未來研究方向

針對免疫病理和致病機制開展深入研究，將有利于未來疫苗和治療藥物的開發(fā)和研制。埃博拉病毒如何下調免疫應答的機制值得深入研究，如何介導淋巴細胞凋亡，病毒如何損害抗原呈遞細胞加工抗原的能力？特別是處于獲得性免疫應答核心環(huán)節(jié)的樹突狀細胞，埃博拉病毒增殖過程中是否對于不同發(fā)育階段的樹突狀細胞有所選擇？病毒對于血管內皮細胞直接損傷具體機制如何？目前的疫苗研究，主要限于扎伊爾型埃博拉病毒，缺乏其他型別的研究，并且集中于非人靈長類動物實驗。未來應繼續(xù)深入探討候選疫苗針對其他型別埃博拉病毒的是否存在差異。未來還需要開展深入細致的實驗動物的病原學研究，為制定干預措施提供靶標。同時，有希望的治療方案和疫苗應向臨床實驗推進，并為應急處置，如實驗室暴露提供儲備?！?/p>