王寅彪 王利平 李鵬

1 前言

2014年暴發(fā)的埃博拉病毒?。‥VD）給西非多國造成了重大人員傷亡和經(jīng)濟(jì)損失，并在英國和美國等國家本土出現(xiàn)感染病例，被WHO 稱為“聯(lián)合國成立以來最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)”。EVD 又稱埃博拉出血熱，是由埃博拉病毒（EBOV）感染人或非人靈長類動 物（NHP）引起的一種烈性傳染病，病死率高達(dá)90%，感染者以出血、發(fā)熱、低血壓、多臟器受損等為主要臨床表現(xiàn)。EBOV 與馬爾堡病毒（MARV）同屬于絲狀病毒科，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒，其基因組大小約19 kb，編碼7 種蛋白：核蛋白（NP）、VP35、VP30、L、糖蛋白（GP）、VP40 和VP24 蛋白。根據(jù)發(fā)生地和抗原特性不同，EBOV可分為：扎伊爾型（ZEBOV）、蘇丹型（SUDV）、本迪布焦型（BDBV）、塔伊森林型（TAFV）和雷斯頓型（RESTV）；除了RESTV對人不致病外，其余4 種EBOV 感染均可導(dǎo)致人發(fā)病，其中ZEBOV 和SUDV 對人有致死性。EBOV 的GP蛋白在病毒囊膜表面形成三聚體，介導(dǎo)病毒入侵宿主靶細(xì)胞，是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的重要蛋白，幾乎所有EBOV 候選疫苗均使用GP 蛋白作為免疫原。

2 EBOV 疫苗

現(xiàn)有的EBOV 疫苗有DNA 疫苗、重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗及病毒載體疫苗等。常用的評價(jià)EBOV 疫苗效力的小型實(shí)驗(yàn)動物模型有小鼠、豚鼠和敘利亞金黃地鼠，非人靈長類動物（NHP）模型有恒河猴、獼猴和狨猴。當(dāng)前對于EBOV 感染的免疫清除機(jī)制尚不清楚，也無明確的保護(hù)性指標(biāo)。疫苗免疫后，通常利用結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測抗體與重組蛋白或與滅活病毒粒子的結(jié)合能力對體液免疫水平進(jìn)行評價(jià)，利用病毒中和試驗(yàn)測定抗體的中和活性；細(xì)胞免疫水平一般通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法（ICS）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測（ELISPOT）測定病毒抗原特異性細(xì)胞因子或分泌特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率進(jìn)行 評價(jià)。

2.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗采用在體內(nèi)表達(dá)外源基因的方式可模仿病毒感染，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。使用表達(dá)GP 或NP 蛋白的DNA疫苗進(jìn)行3～4 次免疫（1.5 μg/次）可保護(hù)小鼠免受致死劑量EBOV 攻毒。表達(dá)GP 蛋白的多價(jià)絲狀病毒疫苗可保護(hù)小鼠和豚鼠免受致死劑量EBOV 和MARV 的攻毒，該疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的殺傷性T 淋巴細(xì)胞（CTL）應(yīng)答。在NHP 免疫實(shí)驗(yàn)中，肌肉電轉(zhuǎn)（500 μg/次）表達(dá)GP 蛋白的質(zhì)粒3 次可誘導(dǎo)獼猴體內(nèi)產(chǎn)生高水平的中和抗體并保護(hù)其抵抗致死劑量EBOV 攻毒（5/6）。使用表達(dá)GP 或NP 蛋白的DNA 疫苗進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)表明DNA 疫苗安全性高，免疫原性良好，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生GP 或NP 蛋白特異性抗體及特異性CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞免疫。雖然DNA 疫苗可量產(chǎn)，而且產(chǎn)生的副反應(yīng)較輕，但需要進(jìn)行多次免疫才能起到相應(yīng)的保護(hù)效果。

2.2 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗具有純度高、安全性好等特點(diǎn)，可使用原核（如大腸桿菌）和真核（如桿狀病毒）等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大量制備，其免疫效果受免疫次數(shù)、佐劑類型等影響較大。PHOOLCHAROEN 等利用在本生煙草中表達(dá)的EBOV_GP1 蛋白及其單抗復(fù)合物與不同的佐劑混合對小鼠進(jìn)行4 次免疫獲得了80%以上的保護(hù)率，且發(fā)現(xiàn)IgG2a 與保護(hù)率非常相關(guān)，與之前研究發(fā)現(xiàn)給小鼠被動免疫IgG2a 單抗可對EBOV 攻毒起到保護(hù)作用的結(jié)果一致。KONDURU 等使用CHO細(xì)胞表達(dá)了EBOV GP 蛋白胞外區(qū)與人源IgG1Fc段的融合蛋白作為疫苗免疫小鼠4次，誘導(dǎo)產(chǎn)生了GP 蛋白特異性的T細(xì)胞應(yīng)答及中和抗體，并能夠保護(hù)小鼠免于致死劑量EBOV 攻擊（7/8）；而且，此融合蛋白可形成同源三聚體，與天然病毒粒子上的GP 蛋白結(jié)構(gòu)類似，具有用作安全、高效的亞單位疫苗的潛力。KONDURU 等同樣利用豚鼠實(shí)驗(yàn)測試了GP-Fc 疫苗的免疫效力，發(fā)現(xiàn)以Poly-ICLC 作為佐劑時(shí)，能夠100%保護(hù)豚鼠免于致死劑量EBOV 攻毒，而且發(fā)現(xiàn)以此種亞單位疫苗免疫豚鼠后產(chǎn)生的GP蛋白特異性抗體水平與保護(hù)率之間并無相關(guān)性。相對于GP 蛋白而言，VP24 和VP40 蛋白在絲狀病毒中的保守性非常高，適用于通用疫苗制備，而且VP24 和VP40 蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)宿主的保護(hù)性免疫應(yīng)答。LEHRER 等使用果蠅 S2 細(xì)胞共表達(dá)了 EBOV 的GP、VP24 和VP40 蛋白，該疫苗在小鼠體內(nèi)免疫原性非常強(qiáng)，能夠100%保護(hù)小鼠免于致死劑量EBOV攻毒，即便在未使用佐劑的情況下進(jìn)行3 次免疫后也能獲得70%的保護(hù)率。

2.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒疫苗（VLP）是不含病毒核酸，形態(tài)類似于天然病毒粒子的一類疫苗，具有安全性好，免疫原性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠被APC 細(xì)胞高效識別，刺激免疫應(yīng)答產(chǎn)生，已在HIV 病毒、HBV 病毒、HPV 病毒、流感病毒、MARV 病毒疫苗研制中進(jìn)行過測試。WARFIELD 等向HEK 293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染表達(dá)EBOV GP 蛋白、VP40 蛋白和NP 蛋白的質(zhì)粒制備了VLP 疫苗，免疫后對小鼠、豚鼠、獼猴均提供了100%保護(hù)率；而且，共表達(dá)EBOV 的GP 蛋白與MARV 的VP40 蛋白或共表達(dá)EBOV的VP40 蛋白與MARV 的GP 蛋白時(shí)，均能形成VLP，為制備抗絲狀病毒的通用疫苗提供了依據(jù)。VLP疫苗免疫同樣受佐劑類型影響，使用模式識別受體PRR 的激動劑作為佐劑時(shí)，可有效提高疫苗效力。BENGTSSON 等利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了EBOV 的GP 蛋白，純化后GP 蛋白形成了30～40 nm 的顆粒，與Matrix-M 佐劑混合免疫小鼠3 次后對致死劑量EBOV 攻毒提供了100%保護(hù)率，而使用Al-PO4 作為佐劑時(shí)則無保護(hù)性，單獨(dú)使用GP 蛋白免疫后保護(hù)率為10%，而且Matrix-M 佐劑組的小鼠能夠迅速產(chǎn)生GP 蛋白特異性IgG及中和抗體，骨髓中GP 蛋白特異性B 細(xì)胞持續(xù)周期更長，分泌GP 蛋白特異性IFN-γ 的T 細(xì)胞數(shù)量更多。

2.4 病毒載體疫苗

用于EBOV 疫苗制備的病毒載體有：腺病毒（rAdv）、痘病毒（MVA）、水皰性口炎病毒（VSV）、復(fù)制型人副流感病毒（HPIV）、狂犬病毒（rRABV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、基于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE）的RNA 復(fù)制子（VRP）等。在美國、歐洲及非洲進(jìn)行臨床測試的EBOV 疫苗均以GP 蛋白為靶標(biāo)，其中一些采用單針免疫，一些采用2 次免疫（首免＋加強(qiáng)免疫不同的疫苗，heterologous prime-boost approach），2 次免疫比單針免疫免疫效果更好，但2 次免疫的推廣受限于EBOV 流行地區(qū)的經(jīng)濟(jì)條件及后勤運(yùn)輸保障等因素。而且，EBOV病毒載體疫苗因使用的載體和測試動物不同，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的情況各異。VSV 載體疫苗免疫NHP 后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答對保護(hù)至關(guān)重要，細(xì)胞免疫應(yīng)答在單針rAdv 載體疫苗免疫后產(chǎn)生的免疫保護(hù)中至關(guān)重要。體液免疫及細(xì)胞免疫均對NHP抵抗EBOV 感染具有保護(hù)作用，人體自然感染EBOV 后也能夠同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，因此，良好的EBOV 疫苗應(yīng)能夠同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生較長持續(xù)周期的細(xì)胞免疫力和抗體水平。

2.4.1 基于腺病毒載體的EBOV 疫苗LEDGERWOOD 等制備了表達(dá)GP 蛋白的人腺病毒5 型載體疫苗（rAd5-GP），并進(jìn)行了單針免疫臨床測試，該疫苗安全性較好，但免疫效果受機(jī)體內(nèi)腺病毒預(yù)存抗體的制約而使得GP 蛋白特異性抗體滴度較低。增加免疫劑量雖然能夠克服這一缺陷，但與此同時(shí)也增強(qiáng)了副反應(yīng)，而且預(yù)存的5 型腺病毒抗體能夠增加受試者感染HIV 的風(fēng)險(xiǎn)。基于復(fù)制缺陷型黑猩猩3 型腺病毒載體制備的 EBOV 疫苗（ChAd3-GP）于2014—2016年分別在美國、英國、瑞士及非洲馬里開展了 I期臨床測試：單針免疫該 疫苗在受試者體內(nèi)產(chǎn)生了顯著的體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答，且抗體水平持續(xù)6個(gè)月依舊明顯，該疫苗產(chǎn)生的副作用較輕，安全性較好，同時(shí)減少了預(yù)存抗體的干擾。我國研究人員制備了表達(dá)2014 基因型EBOV 流行株GP 蛋白的rAd5 疫苗，已在我國及塞拉利昂健康成人中進(jìn)行了I期和II期臨床試驗(yàn)，單次免疫8.0×1010個(gè)病毒粒子可誘導(dǎo)GP蛋白特異性抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，且為凍干型，常溫下可穩(wěn)定 熱帶地區(qū)使用。

2.4.2 基于MVA病毒載體的EBOV疫苗改良型痘苗病毒安卡拉株載體（MVA）是一種復(fù)制缺陷型病毒載體，已被用于天花、瘧疾、流感及結(jié)核疫苗研發(fā)。表達(dá)EBOV 病毒GP 蛋白的MVA（MVAGP）疫苗 免疫豚鼠后僅提供了部分保護(hù)，3 次免疫獼猴之后，動物均出現(xiàn)了病毒血癥。因此，當(dāng)前MVA-GP 疫苗主要被用作加強(qiáng)免疫。ChAd3-GP 免 疫NHP 后可在短期內(nèi)對EBOV 攻毒感染提供100%免疫保護(hù)，然而要想10個(gè)月后仍獲得完全保護(hù)，則需要使用MVA-GP 疫苗作加強(qiáng)免疫。鑒于這種首免+加強(qiáng)免疫的策略在臨床前試驗(yàn)中提供的超強(qiáng)保護(hù)持續(xù)期，一些I期臨床試驗(yàn)在人群中測試了這一方案。與ChAd3-GP 疫苗單針免疫相比，使用ChAd3-GP 首免，2～3個(gè)月后加強(qiáng)免疫表達(dá)EBOV、SUDV 及MARV 病毒GP 蛋白及TAFV 病毒NP 蛋白的重組MVA 載體疫苗在人體內(nèi)獲得了更好的安全譜，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答。

2.4.3 基于VSV 病毒載體的EBOV疫苗重組水皰性口炎病毒（VSV）能夠有效遞送外來抗原，已在HIV病毒、流感病毒、丙肝病毒和乙肝病毒等疫苗研制中得到應(yīng)用，而 且機(jī)體內(nèi)預(yù)先存在VSV 病毒抗體的可能性較小。對NHP 單針肌肉注射1×107pfu 的rVSV-GP（ZEBOV）疫苗28 d 后，能夠保護(hù)其免受致死劑量的同源ZEBOV 病毒（1000 pfu）的攻擊，但對SUDV 攻毒無交叉保護(hù)，對rVSV-GP 誘導(dǎo)保護(hù)的機(jī)制進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)抗體應(yīng)答在保護(hù)中不可或缺，而且抗體水平與保護(hù)率直接相關(guān)。另外，肌內(nèi)免疫rVSV-GP（ZEBOV）疫苗后可保護(hù)以氣溶膠方式進(jìn)行的ZEBOV 攻毒，而且通過鼻腔或口腔黏膜免疫該疫苗也可保護(hù)以肌肉注射進(jìn)行的ZEBOV攻毒，表明黏膜免疫同樣在rVSV- GP（ZEBOV）疫苗免疫后產(chǎn)生的保護(hù)中發(fā)揮重要作用。最近一項(xiàng)研究表明使用rVSV-GP 疫苗免疫NHP 7 d 即可為致死劑量ZEBOV 攻毒 提供100% 保護(hù)，因此，該疫苗可用于保護(hù)一線醫(yī)療救護(hù)人員及受感染威脅的社區(qū)，從而在早期減少疫情的擴(kuò)散。GEISBERT 等則利用rVSV表達(dá)了多種絲狀病毒的GP 蛋白，混合制備了通用疫苗，免疫NHP 后可保護(hù)動物同時(shí)免受EBOV（ZEBOV，SUDV，TAFV）及MARV 感染。

2.4.4 基于副黏病毒載體的 EBOV疫苗人3 型副流感病毒（HPIV-3）是一種引起兒童下呼吸道感染的副黏病毒（paramyxovirus）。單次鼻腔內(nèi)免疫表達(dá)EBOV 病毒GP 或NP蛋白的重組人3 型副流感病毒疫苗（rHPIV3/ZEBOV-GP 或rHPIV3/ ZEBOV-GP/NP）可以保護(hù)豚鼠免受致死劑量EBOV 病毒攻擊，通過呼吸道途徑2 次免疫恒河猴也可提供100%保護(hù)。MEYER 等對比了通過呼吸道途徑免疫氣溶膠形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗、液體形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗及肌肉免疫表達(dá)GP 蛋白的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VRP-GP）產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)氣溶膠形式的rHPIV3/ZEBOV- GP 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高水平的血液和黏膜IgG、IgA 及中和抗體，更強(qiáng)程度的CD4＋T 細(xì)胞應(yīng)答，而且單次氣溶膠疫苗免疫為獼猴提供了100%保護(hù)率。雖然呼吸道免疫rHPIV3 載體疫苗可使受試者免于針注，但其免疫效果可能受到體內(nèi)預(yù)存抗體的影響。

2.4.5 基于其他病毒載體的EBOV疫苗BLANEY 等制備了表達(dá)EBOV 病毒GP 蛋白的重組狂犬病毒疫苗（rRABV/ZEBOV-GP），這種2 價(jià)疫苗免疫可同時(shí)預(yù)防狂犬病毒及EBOV 的感染，單次免疫即可對致死劑量EBOV 攻毒提供100%保護(hù)，而且保護(hù)作用與抗體應(yīng)答相關(guān)，其中IgG1 型抗體應(yīng)答在免疫保護(hù)中起重要作用。

巨細(xì)胞病毒（CMV）可在其宿主群體中重復(fù)感染與傳播，不受預(yù)存免疫力的影響。TSUDA 等制備了表達(dá)ZEBOV 病毒NP 蛋白CTL 表位（43-54 aa）的重組CMV 疫苗，單次免疫該疫苗后，較快誘導(dǎo)產(chǎn)生了此表位特異性的CTL 應(yīng)答，2 次免疫小鼠后，可使其經(jīng)受住致死劑量EBOV 攻毒，但體內(nèi)仍存在EBOV病毒復(fù)制，這一結(jié)果表明CTL 應(yīng)答在免疫保護(hù)中起重要作用，但需要在其他動物模型上進(jìn)行更多驗(yàn)證。

PUSHKO 等基于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE）制備了RNA 復(fù)制子疫苗（VRP-GP 及VRPNP），單獨(dú)免疫VRP-GP 或與VRP-NP 同時(shí)免疫能夠?qū)π∈蠛碗嗍笃鸬奖Ｗo(hù)作用，僅免疫VRP-NP 只保護(hù)小鼠，不保護(hù)豚鼠，研究未發(fā)現(xiàn)抗體水平與保護(hù)率之間的相關(guān)性。HERBERT 等 發(fā)現(xiàn)單次經(jīng)肌肉注射VRP-SUDV-GP與VRP-ZEBOV-GP能夠完全保護(hù)獼猴免受致死劑量ZEBOV 或SUDV攻擊。

3 研究展望

當(dāng)前已進(jìn)入臨床測試的EBOV疫苗有DNA 疫苗、rAd5 疫苗、ChAd3疫苗及rVSV 疫苗。DNA 疫苗免疫原性稍弱，需要進(jìn)行多次免疫；rAd5疫苗可受預(yù)存抗體的干擾，需要使用較高的劑量予以克服；ChAd3 疫苗免疫可在短期內(nèi)提供較好保護(hù)，但持續(xù)期有待延長，故多采用ChAd3疫苗進(jìn)行首免，MVA 疫苗作加強(qiáng)免疫；rVSV 疫苗能夠在10 d 內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)，仍需更多臨床測試來確定免疫保護(hù)的持續(xù)期。針對EBOV感染的免疫保護(hù)機(jī)制是復(fù)雜的，而且這一機(jī)制針對不同類型的疫苗也不一樣，大多數(shù)疫苗測試中，GP 糖蛋白特異性的體液免疫力不可或缺且足以保護(hù)受試者免受感染；細(xì)胞免疫對單針rAdv 載體疫苗免疫后產(chǎn)生的保護(hù)至關(guān)重要，而且CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答在VLP（GP-VP40）免疫后產(chǎn)生的保護(hù)中也是必需的。鑒于傳染病的暴發(fā)具有不可測性，對一線醫(yī)療救護(hù)人員單針普免絲狀病毒多價(jià)疫苗是應(yīng)對此種突發(fā)公共衛(wèi)生事件所必需的。多價(jià)絲狀病毒疫苗研究是未來EBOV 疫苗發(fā)展的方向。同時(shí)，為更好防止病毒進(jìn)入人群，制備供野生動物使用的EBOV 疫苗對于保護(hù)人群健康也具有重要作用，這有待于對EBOV 儲存宿主的進(jìn)一步確證，從而在傳播的早期階段或者針對中間宿主或終末宿主如猿類進(jìn)行干預(yù)?！?/p>