劉曉川，蔡旭新，陳華強(qiáng)

(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶，526040)

啟動子是基因表達(dá)的重要作用元件，不僅在遺傳代謝調(diào)控作為關(guān)鍵調(diào)控因子起作用，在異源基因高效表達(dá)中也有重要的地位[1-2]。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)是原核表達(dá)系統(tǒng)中的一種重要表達(dá)系統(tǒng)，具有外源蛋白分泌能力強(qiáng)、不易形成包涵體、分泌的外源蛋白易分離純化、無致病性等特點，很多外源蛋白都在芽孢表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[2-3]。挖掘性能優(yōu)良的啟動子對于芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的作用毋庸置疑。

解淀粉芽孢桿菌是一種重要工業(yè)微生物，是多種工業(yè)酶(α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶)的生產(chǎn)宿主[4]。以其為出發(fā)菌株挖掘強(qiáng)啟動子不僅有助于為芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)提供有效的調(diào)控元件，也有助于加深對該菌株的了解。

本文以β-半乳糖苷酶基因(bgaB)作為報告基因的啟動子探針載體篩選解淀粉芽孢桿菌中的強(qiáng)啟動子，捕抓到一個強(qiáng)度較高的串聯(lián)啟動子，并且該啟動子成功運用于木聚糖酶基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

啟動子篩選出發(fā)菌株解淀粉芽孢桿菌XH7(BacillusamyloliquefaciensXH7)為本公司保存；大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α購于大連Takara公司；枯草芽孢桿菌WB800 (BacillussubtilisWB800)、啟動子探針質(zhì)粒pBE-bgaB、表達(dá)質(zhì)粒pBEP43-bgaB、pBEP43-xyn由華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院保存。表達(dá)質(zhì)粒pBEP28-bgaB，pBEP28-xyn為本實驗構(gòu)建。

1.2 試劑

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA Ligase均購于Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒購于OMEGA公司；X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)購于大連Takara公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(oNPG)購于Sigma公司。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min，必要時加入適當(dāng)濃度的抗生素。大腸桿菌培養(yǎng)加入質(zhì)量濃度100 ng/mL氨芐青霉素(Amp)，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)加入質(zhì)量濃度25 ng/mL卡那霉素(Kan)。啟動子篩選平板加入終濃度0.2 mmol/L X-gal。

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以pBEP28-bgaB質(zhì)粒為模板，為引物P28-F/R(表1)擴(kuò)增P28片段，擴(kuò)增片段5’和3’端分別帶有EcoRⅠ和SalⅠ 2個限制性酶切位點，片段純化、雙酶切后連接于相同酶切位點酶切載體質(zhì)粒pBEP43-xyn，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，測序驗證得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pBEP28-xyn。

1.5 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800參考電轉(zhuǎn)化方法[5]。

1.6 β-半乳糖苷酶酶活測定

將重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，離心收集細(xì)胞后超聲破碎細(xì)胞，測定β-半乳糖苷酶的酶活[2]。每分鐘分解ONPG釋放1 μmol ONP和1 μmol半乳糖所需的酶量為1個酶活單位。

1.7 SDS-PAGE分析

質(zhì)量濃度為50 g/L濃縮膠和120 g/L分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色。

1.8 測序和序列分析

DNA引物合成與測序送交英濰捷基測序公司完成。序列的分析比對通過NCBI在線Web blast完成(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通過BPROM(http://linux1.softberry.com)預(yù)測啟動子的啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)，DBTBS (http://dbtbs.hgc.jp/)分析啟動子的σ因子類型。

表1 引物及核苷酸序列

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子的克隆

啟動子探針質(zhì)粒pBE-bgaB(圖1-a)是以β-半乳糖苷酶為報告基因的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，設(shè)計帶SD序列的β-半乳糖苷酶(bgaB)基因起始密碼子之前無啟動子序列。MboI不完全酶切解淀粉芽孢桿菌XH7基因組，回收100～500 bp大小范圍的片段如圖1-b所示，純化回收的酶切片段。探針質(zhì)粒pBE-bgaB用BclI單酶切開與回收的基因組片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后的菌涂布于添加了X-gal的啟動子篩選平板上，挑取篩選平板上的藍(lán)色菌落，并測定其β-Gal酶活。從64株陽性重組子篩選得到1株β-Gal酶活最高的菌株P(guān)28，對其進(jìn)行強(qiáng)度驗證和序列分析。

M-DL2000 DNA Marker；1,2-解淀粉芽孢桿菌XH7基因組

圖1 啟動子探針質(zhì)粒pBE-bgaB圖譜(a)和基因組DNA酶切電泳(b)

Fig.1 A map of the promoter trap plasmid pBE-bgaB (a) and total DNA partial digested (b)

2.2 篩選的啟動子強(qiáng)度

克隆子中篩選的β-Gal酶活最高的重組菌株P(guān)28，考察其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的β-Gal酶活，如圖2-a所示，P28在大腸桿菌中的β-Gal酶活為2350 Miller U/mL，在枯草芽孢桿菌中的酶活為3340 Miller U/mL，在枯草芽孢桿菌中的酶活強(qiáng)度與來源于枯草芽孢桿菌的組成型強(qiáng)啟動子P43[2]的強(qiáng)度接近，該結(jié)果與SDS-PAGE檢測的結(jié)果一致(圖2-b)。結(jié)果顯示在70 kDa處有清晰的條帶，與目標(biāo)蛋白分子量大小一致，表明在P28和P43啟動子調(diào)控下的重組質(zhì)粒bgaB報告基因成功表達(dá)。

M-蛋白Marker；P28-枯草芽孢桿菌WB800(pBEP28-bgaB)在24 h的蛋白樣品；P43-枯草芽孢桿菌WB800(pBEP43-bgaB)在24 h的蛋白樣品。

圖2 啟動子的β-Gal酶活測定(a)和SDS-PAGE驗證(b)

Fig.2 β-Gal activities of clones in B.amyloliquefaciens(a) and SDS-PAGE analysis(b)

2.3 啟動子的序列分析

對啟動子P28進(jìn)行測序，并與解淀粉芽孢桿菌XH7基因組序列進(jìn)行比對，該片段長993 bp,有4個片段，從5’—3’的順序是yodH-ctpA部分編碼區(qū)片段(303 bp，yodH編碼S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，ctpA編碼羧基末端加工蛋白酶)，gabT部分編碼區(qū)片段(161 bp，編碼4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶)，dhaS部分編碼區(qū)片段(180 bp，編碼醛脫氫酶)，fbaA-tal部分編碼區(qū)片段(349 bp，fbaA編碼果糖二磷酸醛縮酶,tal編碼轉(zhuǎn)醛酶)。如圖3-a所示，第2個片段和第3個片段落在gabT和dhaS基因編碼框內(nèi)，具有啟動子活性的可能性較小，而第1個片段和第4個片段均有起始密碼子前端序列，因此推測P28啟動子是串聯(lián)型的啟動子，由啟動子PctpA和啟動子Ptal串聯(lián)。通過softberry啟動子預(yù)測P28兩個串聯(lián)啟動子的-35區(qū)和-10區(qū)，如圖3-b所示。將上述的啟動子片段一(yodH-ctpA部分編碼區(qū)片段，303 bp)和啟動子片段四(fbaA-tol部分編碼區(qū)片段，349 bp)提交DBTBS數(shù)據(jù)庫分析得到，PctpA啟動子是由σK因子識別調(diào)控的。σK因子是轉(zhuǎn)錄孢子形成Ⅳ期母細(xì)胞的基因編碼[1,6]。

a-方框表示的是P28啟動子4個組成片段及其所在基因位置;b-虛線框內(nèi)表示的是啟動子-35區(qū)、-10區(qū)和RBS位點

圖3 啟動子P28結(jié)構(gòu)示意圖(a)與序列分析(b)

Fig.3 Schematic diagram (a) and sequence (b) of promoter P28

2.4 篩選的啟動子應(yīng)用

將篩選的啟動子亞克隆表達(dá)木聚糖酶基因(xyn)，圖4結(jié)果顯示在40 kDa處有清晰的條帶，與目標(biāo)蛋白分子量大小一致，說明重組質(zhì)粒在啟動子P28的啟動下成功表達(dá)xyn基因。

M-蛋白Marker；P28-枯草芽孢桿菌WB800(pBEP28-xyn)在24 h的蛋白樣品

圖4 pBEP28-xyn在枯草WB800中的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of pBEP28-xyn in B.subtilis

3 討論

用啟動子探針載體捕抓啟動子是一種被廣泛使用的高效分離鑒定原核啟動子的方法，其方法不僅簡單有效，還可以雜合出新的啟動子[2,7-8]。

芽孢桿菌的啟動子類型較多(豐富的σ因子)，其表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較復(fù)雜，因此需要豐富的啟動子庫來表達(dá)各種外源基因[6,9]。啟動子庫里面不僅需要各種表達(dá)強(qiáng)度的啟動子，也需要各種芽孢桿菌屬來源的啟動子，因此擴(kuò)大啟動子搜索的出發(fā)菌株也是行之有效的方法[10-11]。

本文以解淀粉芽孢桿菌為宿主，為芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究貢獻(xiàn)了可以利用的啟動子，但需要進(jìn)一步優(yōu)化P28啟動子的強(qiáng)度，如刪去啟動子的多余序列，優(yōu)化2個啟動子串聯(lián)的距離等。