林翠，唐雯，顧金燕,2，金玉蘭，董偉仁，廖敏，周繼勇

1 浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058

2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 免疫研究所，江蘇 南京 210000

豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2) 是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS) 的主要病原[1]。該病流行范圍廣、傳播速度快，是嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一[2]。PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的最小動(dòng)物病毒，病毒粒子直徑約為17 nm，無囊膜，基因組為單鏈環(huán)狀DNA[3]。PCV2基因組全長(zhǎng)1 766–1 768 nt，預(yù)測(cè)含有11個(gè)開放閱讀框(Open reading frame, ORF)[4]。目前僅5個(gè)orf的編碼產(chǎn)物被證實(shí)，orf1編碼的Rep和Rep’蛋白，是病毒的復(fù)制酶[5]；orf2編碼衣殼蛋白Cap，是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒引起宿主免疫應(yīng)答的主要抗原[6-7]；orf3、orf4和orf5編碼的蛋白非病毒復(fù)制所必需，前兩者與病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)[8-9]，后者可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及NF-κB的激活相關(guān)[10]。

前期研究報(bào)道，ORF4蛋白的缺失不僅影響病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平，還影響了宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞數(shù)量[9]，提示ORF4蛋白與病毒致病力密切相關(guān)。Gao等對(duì)比orf4缺失毒與野毒感染情況下病毒各蛋白轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)缺失毒感染后orf3轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野毒，從而推測(cè)ORF4蛋白通過降低orf3轉(zhuǎn)錄量間接抑制凋亡誘導(dǎo)[11]。Lv等通過酵母菌雙雜交試驗(yàn)篩選出4個(gè)與ORF4結(jié)合的宿主蛋白，利用激光共聚焦、免疫共沉淀及GST pull down試驗(yàn)證實(shí)重鏈鐵蛋白 (Ferritin heavy chain，F(xiàn)HC) 與ORF4蛋白結(jié)合[12]。深入探究發(fā)現(xiàn)FHC與ORF4結(jié)合致使胞內(nèi)FHC濃度減少，隨后抑制活性氧簇 (Reaction oxygen species，ROS) 的大量聚集，最終拮抗凋亡[13]。最近，本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)ORF4具有核質(zhì)雙重定位特征，定位胞漿的ORF4蛋白與線粒體內(nèi)膜蛋白腺嘌呤易位體 3 (Adenine nucleotide translocator 3，ANT3) 結(jié)合激活線粒體凋亡通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]?，F(xiàn)今，對(duì)ORF4的研究主要與凋亡相關(guān)，該蛋白的其他特性及功能仍不甚明了。因此，探討并揭示ORF4的胞內(nèi)互作蛋白有助于對(duì)ORF4功能的研究。文中通過GST pull-down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)細(xì)胞中與ORF4互作的潛在蛋白進(jìn)行篩選和鑒定。嘗試尋找ORF4參與病毒感染的具體通路，為ORF4蛋白的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物材料及主要試劑

PCV2 HZ0201株 (AY188355) 由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存[4]；HEK293T cells (ATCC，CRL-11268) 購自ATCC細(xì)胞庫并由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；克隆宿主菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pGEX-4T-1購自GE Healthcare Life Biosciences公司；pCMV-N-Flag真核表達(dá)載體及pDsRed2-Mito購自Clontech Laboratories公司；UNIQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Flag鼠單抗購自Sigma-Aldrich公司；GST鼠單抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；ORF4鼠單抗6A5由本實(shí)驗(yàn)室保存；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG (H+L)購自美國(guó)KPL公司；DAPI購自Roche Life Science公司；谷胱甘肽瓊脂糖珠 (GST) 購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 pCMV-N-Flag-GST真核表達(dá)載體改造及pCMV-N-Flag-GST-ORF4重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 pCMV-N-Flag-GST真核表達(dá)載體改造

以pCMV-N-Flag質(zhì)粒為骨架構(gòu)建含F(xiàn)lag以及GST雙標(biāo)簽的重組質(zhì)粒用于后續(xù)研究。首先，使用Hind Ⅲ酶切載體pCMV-N-Flag，回收備用，同時(shí)以原核表達(dá)載體pGEX-4T-1為模板擴(kuò)增gst片段，再通過同源重組方法將gst片段插入至pCMV-N-Flag載體多克隆位點(diǎn) (MCS) 中Hind Ⅲ下游，且保證不影響Hind Ⅲ下游MCS的使用。擴(kuò)增gst的引物序列為：GST-上游引物：5′-CAAG GACGACGATGACAAGCTTATGATTAGTGTACA CCACC-3′，GST-下游引物：5′-CGAATTCGGGCCTCCATGGCCATTATATCAGCAGAATTTC-3′ (下劃線部分為同源重組臂)。

1.2.2 構(gòu)建pCMV-N-Flag-GST-ORF4重組質(zhì)粒

使用病毒基因組抽提試劑盒提取的PCV2 HZ0201的基因組為模板，引物：ORF4-上游引物：5′-CGGAATTCGGATGACGTGTACATTAGTCTT CC-3′，ORF4-下游引物：5′-CCCTCGAGTCAGGG ACAACGGAGTGACCTGTC-3′ (下劃線部分為酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增獲得orf4片段，利用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切改造過的pCMV-N-Flag-GST載體及orf4目的片段，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，陽性克隆經(jīng)測(cè)序完全正確后，提取質(zhì)粒用于后續(xù)研究。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

長(zhǎng)滿單層的293T細(xì)胞，使用0.05%胰酶消化1–2 min，待細(xì)胞間隙變大后，使用含2%血清的培養(yǎng)基終止消化，并按1∶2的比例傳代到指定的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12–16 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%–80%，即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程參見說明書。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 總蛋白提取、SDS-PAGE和免疫印跡

收集并裂解細(xì)胞樣品。首先，棄掉培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS潤(rùn)洗3次，最后一次加入PBS后將細(xì)胞收集到1.5 mL EP管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入90 μL的細(xì)胞強(qiáng)裂解液 (主要成分為2% SDS、1% Triton X-100) (以六孔板為例)，并將細(xì)胞沉淀吹懸后完全裂解，隨后按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，混勻煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清上樣。

按照《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[15]中的方法配制12%聚丙烯酰胺凝膠，將待檢樣上樣電泳，80 V、30 min將樣品壓成線后再以120 V恒壓電泳至條帶充分分離，結(jié)束電泳。通過半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm硝酸纖維素膜 (Nitrocellulose filter membrane，簡(jiǎn)稱NC膜) 上，NC膜經(jīng)5%脫脂乳封閉處理后進(jìn)行抗體孵育，并顯色。其中孵育的一抗包括抗Flag鼠單抗 (1∶2 000)，GST鼠單抗 (1∶4 000)，ORF4鼠單抗 (1∶200)，對(duì)應(yīng)的二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗 (1∶8 000)。

1.5 激光共聚焦顯微鏡試驗(yàn)

細(xì)胞傳代后接種到共聚焦小皿內(nèi)，待長(zhǎng)滿40%–50%，將DsRed-mito分別與pCMV-N-Flag-GST和pCMV-N-Flag-GST-ORF4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，使用4%多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞20 min，0.2% Trinton X-100透化細(xì)胞2 min，經(jīng)5%脫脂奶封閉后，孵育一抗Flag鼠單抗，并用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗 (1∶200) 指示蛋白，DAPI (10 μg/mL) 室溫染核10 min指示細(xì)胞核，洗滌加入PBS，使用蔡司LSM780激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 GST pull-down試驗(yàn)

分別收集轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-GST及pCMVN-Flag-GST-ORF4細(xì)胞樣品 (約1×107個(gè)細(xì)胞)，加入1 mL NP40裂解液 (PMSF終濃度1 mmol/L)，冰浴裂解細(xì)胞30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清；隨后向上清中加入GST瓊脂糖珠50 μL，4 ℃混懸儀孵育4 h，1000 r/min離心5 min后棄上清，再加入1 mL的PBS洗滌4次，最后一次洗滌后，棄上清并加入45 μL PBS，同時(shí)加入15 μL的4×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE (12%凝膠) 分離蛋白。

1.7 銀染試驗(yàn)

GST pull-down樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，將聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)入固定液 (V無水乙醇∶V冰乙酸∶V雙蒸水= 4∶1∶5) 中室溫固定30 min；雙蒸水清洗后轉(zhuǎn)入敏化液 (醋酸鈉68 g，硫代硫酸鈉3.14 g，無水乙醇0.3 L，加入雙蒸水定容至1 L) 孵育30 min，隨后雙蒸水漂洗3次；再將凝膠放入銀染液 (硝酸銀2.5 g，37%甲醛100 μL，雙蒸水配平至1 L)中避光孵育25 min，雙蒸水淋洗后加入顯色液 (無水碳酸鈉25 g，甲醛0.4 mL，硫代硫酸鈉0.0314 g，加入雙蒸水后定容至1 L) 孵育3–7 min，以終止液 (5%冰乙酸) 終止顯色，雙蒸水洗滌后使用ImageScanner Ⅲ 掃描儀掃描凝膠并保存圖片。選擇實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異顯著的條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCMV-N-Flag-GST質(zhì)粒的構(gòu)建

以pGEX-4T-1質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增gst基因片段，獲得約700 bp產(chǎn)物，與預(yù)期gst片段分子大小吻合 (圖1A)。將目的片段按同源重組的方法插入pCMV-N-Flag載體中，pCMV-N-Flag載體以及經(jīng)改造后的 pCMV-N-Flag-GST的圖譜見圖1B。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，插入的gst序列位于pCMV-N-Flag載體中Hind Ⅲ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)下游且序列完全正確。

2.2 ORF4重組質(zhì)粒構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)

以PCV2 HZ0201基因組為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得orf4片段，如圖2A所示。經(jīng)雙酶切后插入到改造成功的pCMV-N-Flag-GST載體中。將構(gòu)建成功的pCMV-N-Flag-GST及pCMV-N-Flag-GSTORF4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，制備蛋白樣品。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western blotting后，分別使用Flag鼠單抗、GST鼠單抗以及ORF4鼠單抗檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)lag-GST融合蛋白分子量約為30 kDa，與預(yù)計(jì)大小一致，能夠被Flag及GST標(biāo)簽抗體識(shí)別，但無法與ORF4抗體反應(yīng)；Flag-GST-ORF4蛋白分子量約為37 kDa，能同時(shí)與3種抗體反應(yīng)。該結(jié)果表明上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可成功表達(dá)。

圖1 pCMV-N-Flag-GST載體構(gòu)建Fig.1 The construction of pCMV-N-Flag-GST.(A) Amplification of gst gene by PCR.(B) The schematic showing that fragment coding GST was cloned into pCMV-N-Flag vector (a), resulting in pCMV-N-Flag-GST recombinant plasmid (b).

圖2 目的基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒表達(dá)Fig.2 Amplification of orf4 gene and analysis of the expression of the recombinant plasmids.(A) PCR amplification of orf4 gene.(B) Western blotting analysis of recombinant Flag-GST and Flag-GST-ORF4 proteins with various antibodies.

2.3 ORF4融合蛋白定位分析

ORF4蛋白分子量?jī)H有6.5 kDa，與大標(biāo)簽融合后有可能會(huì)影響蛋白定位。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)ORF4蛋白定位于線粒體，為了檢測(cè)GST標(biāo)簽蛋白是否會(huì)影響ORF4的胞內(nèi)定位，將pCMV-N-Flag-GST與pCMV-N-Flag-GST-ORF4分別與pDsRed2-Mito共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布。結(jié)果如圖3所示，pDsRed2-Mito在細(xì)胞內(nèi)呈紅色熒光并以點(diǎn)狀或桿狀分布于胞質(zhì)內(nèi)，指示線粒體；pCMV-N-Flag-GST轉(zhuǎn)染細(xì)胞后呈綠色熒光，在胞質(zhì)中呈彌散分布；pCMV-N-Flag-GST-ORF4轉(zhuǎn)染后呈綠色點(diǎn)狀分布，與線粒體存在共定位。上述結(jié)果表明融合蛋白并沒有改變ORF4蛋白的定位，重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 GST pull-down及銀染結(jié)果

分別收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣品，一部分樣品裂解后直接進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如圖4A顯示，實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可正常表達(dá)1、3、5泳道；一部分裂解樣品中加入GST瓊脂糖珠進(jìn)行pull-down試驗(yàn)，顯示融合GST標(biāo)簽的蛋白能與GST瓊脂糖珠成功結(jié)合2、4、6泳道。所有蛋白經(jīng)過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后進(jìn)行銀染。如圖4B所示，與Flag-GST經(jīng)GST pull-down捕獲的蛋白條帶相比，F(xiàn)lag-GST-ORF4兩個(gè)重復(fù)樣品中，在170 kDa以上，70–50 kDa、35–40 kDa處均有1條差異性條帶，在40–55 kDa處有2條差異性條帶，對(duì)差異性條帶進(jìn)行割膠回收和質(zhì)譜分析。

2.5 質(zhì)譜分析結(jié)果

以得分高于40為篩選標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示，共篩選到5個(gè)潛在與ORF4互作的蛋白，它們分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶6催化亞基、α心肌蛋白、肌動(dòng)蛋白、SEC-14樣蛋白5和肌球蛋白myosin 9。其中分?jǐn)?shù)相對(duì)較高蛋白有肌動(dòng)蛋白和myosin 9，兩者均與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)，這預(yù)示著ORF4蛋白很可能與細(xì)胞骨架有關(guān)聯(lián)。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)ORF4蛋白特性及功能的研究提供指向性及理論依據(jù)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡分析Flag-GST (A) 與Flag-GST-ORF4 (B) 的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of Flag-GST (A) and Flag-GST-ORF4 (B) were examined by laser scanning confocal microscope.Flag-GST or Flag-GST-ORF4, green; mitochondria, red; nucleus, blue.

圖4 GST pull-down樣品免疫印跡及銀染結(jié)果Fig.4 Immunoblotting and silver staining results of GST pull-down samples.(A) Lane 1: lysate of Flag-GST;lane 2: the Flag-GST samples after GST pull-down; lane 3, 5: lysates of Flag-GST-ORF4 samples, they are two separate experiments; lane 4, 6 are the Flag-GST-ORF4 samples after GST pull-down, corresponding to 3 and 5 samples.(B) M: marker; lane 1: silver staining of Flag-GST pull down sample; lane 2, 3: silver staining of the two separate Flag-GST-ORF4 pull down assays samples. Differential bands.

表1 GST pull-down結(jié)合質(zhì)譜鑒定出潛在與ORF4互作的蛋白Table 1 Potential intercropping proteins with ORF4 indentified by GST pul-down combined with mass spectrometry

3 討論

豬圓環(huán)病毒ORF4蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的蛋白，其相關(guān)功能的研究還處于初步探索階段。迄今為止，人們對(duì)ORF4蛋白在病毒感染中到底發(fā)揮何種作用知之甚少。病毒蛋白通常與宿主蛋白相互作用來發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此，探尋宿主細(xì)胞內(nèi)與ORF4的潛在互作蛋白可為后續(xù)ORF4功能的研究奠定基礎(chǔ)。研究利用了真核表達(dá)的Flag-GST-ORF4蛋白進(jìn)行GST pull-down試驗(yàn)來捕獲與ORF4蛋白互作的宿主蛋白。將gst融合到pCMV-N-Flag載體上，使用真核表達(dá)的GST融合蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，而非使用原核表達(dá)的GST融合蛋白，更有效地篩選出哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可能與ORF4結(jié)合的蛋白；利用該篩選方法較傳統(tǒng)的原核GST pull-down可信度更高，已有文獻(xiàn)通過此種方法成功篩選到了與流感病毒PB1-F2互作的兩個(gè)蛋白[16]。

本研究利用上述的方法篩選到5種宿主蛋白，其中actin與myosin 9的分值明顯高于其余幾種蛋白，預(yù)示著它們與ORF4互作的可能性很大。Actin (肌動(dòng)蛋白) 是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，幾乎所有的真核細(xì)胞內(nèi)均含有肌動(dòng)蛋白。該蛋白對(duì)真核細(xì)胞的存活至關(guān)重要，它為細(xì)胞形態(tài)維持提供了內(nèi)部機(jī)械支撐，在細(xì)胞內(nèi)部形成微絲，為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸提供重要通道，并且也是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)源[17]。而myosin 9蛋白是肌球蛋白超家族中的一員，也是細(xì)胞骨架重要組成成分。該家族蛋白是與肌動(dòng)蛋白actin結(jié)合的分子馬達(dá)蛋白，可調(diào)節(jié)actin的作用，與肌絲結(jié)合后被活化，活化后蛋白具有ATP酶活性，水解ATP后產(chǎn)生化學(xué)能，從而推動(dòng)肌絲活動(dòng)或產(chǎn)生張力[18]。此外，myosin 9還參與細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理過程，例如細(xì)胞骨架重組、肌動(dòng)蛋白纖維運(yùn)動(dòng)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等[19]。近年來很多研究報(bào)道細(xì)胞骨架，特別是肌動(dòng)蛋白微絲對(duì)病毒運(yùn)輸起著很重要作用。病毒侵入細(xì)胞后，為實(shí)現(xiàn)有效復(fù)制，首先需要將自身遺傳物質(zhì)輸送到核內(nèi)或特定的內(nèi)膜系統(tǒng)膜上。在高度復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)部，蛋白大分子若單純依靠擴(kuò)散運(yùn)輸效率極低。因此，大部分的病毒會(huì)利用細(xì)胞骨架或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸通道來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)運(yùn)輸[20-21]。很多病毒通過這種方式進(jìn)行胞內(nèi)運(yùn)輸，例如桿狀病毒利用肌動(dòng)蛋白微絲實(shí)現(xiàn)病毒基因組由胞質(zhì)到胞核的過程[22]；本實(shí)驗(yàn)室前期也證明了圓環(huán)病毒可通過病毒衣殼蛋白 (cap) 劫持宿主細(xì)胞原有的微管運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行核靶向運(yùn)輸活動(dòng)[23]。此外，本實(shí)驗(yàn)室也分析了豬圓環(huán)感染后的宿主免疫組織基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示解聚因子confilin1和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白 (DSTN) 的非磷酸化活性形式發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，這提示PCV2感染可能促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白actin的解聚和重排，利于病毒入侵與運(yùn)輸[24]。肌動(dòng)蛋白參與不同細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程是基于微絲的組裝及肌球蛋白myosin的活化[25]，病毒可利用actin或actin結(jié)合蛋白來實(shí)現(xiàn)自身的運(yùn)輸過程[26-27]。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)yosin IIA與HIV病毒gB蛋白結(jié)合后促進(jìn)病毒入侵[28]。根據(jù)本文研究結(jié)果，我們推測(cè)ORF4蛋白與myosin結(jié)合，調(diào)節(jié)actin的作用從而間接影響病毒的運(yùn)輸過程；而與actin結(jié)合很可能直接影響著細(xì)胞骨架的排列，進(jìn)而調(diào)控病毒的運(yùn)輸。這為后續(xù)研究ORF4蛋白是否影響細(xì)胞骨架以及病毒的入侵與運(yùn)輸提供了有利的依據(jù)。另外，也有研究表明小GTP酶Ras蛋白通過 cAMP/PKA信號(hào)通路來調(diào)控線粒體功能，而actin參與調(diào)控小GTP酶Ras蛋白[29-30]。藥物處理使actin穩(wěn)定性下降，可誘發(fā)細(xì)胞凋亡[31]。因此，actin與細(xì)胞凋亡息息相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表數(shù)據(jù)顯示ORF4定位線粒體并且與豬圓環(huán)病毒誘導(dǎo)線粒體凋亡相關(guān)[14]。然而，ORF4是否還能通過結(jié)合actin來間接發(fā)揮其誘導(dǎo)線粒體凋亡有待進(jìn)一步研究。后續(xù)研究我們將深入闡明ORF4在病毒感染中發(fā)揮的作用，嘗試揭示影響病毒感染的潛在機(jī)制。