趙江博，李燕，田佳寧，郭鳳英，王碩，楊超，席向東，陳德勝

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨一科，寧夏 銀川 750000)

目前全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)和全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)是較為成熟的外科手術(shù)，可為患者減輕疼痛、改善關(guān)節(jié)功能和提高生活質(zhì)量[1-2]。然而，盡管手術(shù)技術(shù)、假體材料不斷改進(jìn)，但需要進(jìn)行翻修的患者在逐年增加。磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是導(dǎo)致翻修的最常見原因之一[3]。關(guān)于假體周圍骨溶解的病理學(xué)機(jī)制尚未完全明確，并且目前探索假體周圍骨溶解的治療靶點(diǎn)是研究熱點(diǎn)，因此能夠更好的模擬假體周圍骨溶解的病理學(xué)機(jī)制是實(shí)驗(yàn)研究必不可少的條件。本實(shí)驗(yàn)對(duì)目前常用的小鼠顱骨模型和小鼠氣囊植骨模型進(jìn)行比較性研究，為磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的動(dòng)物模型的選擇提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性SPF級(jí)BALB/c 小鼠50只，8～10周齡，體重在(22±3)g之間，健康狀況良好。在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，5只/籠。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將40只小鼠隨機(jī)分為小鼠顱骨模型組、小鼠氣囊植骨模型組，每組20只。顱骨骨片供體組10只。

1.2 材料與試劑 鈦顆粒購自Alfa Aesar公司；蘇木精-伊紅染液、抗石酒酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)免疫組化染色試劑盒購自西安潤德生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛、叔丁醇、12.5% EDTA、乙醇、PBS液購自銀川潤研生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購自上海潤成生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡(Olympus，日本)；離心加速機(jī)(Salfradent，意大利)；真空烘箱；石蠟包埋機(jī)(Olympus，日本)；石蠟切片機(jī)(Olympus，日本)；圖像分析儀(Leica Q-500，德國)；掃描電子顯微鏡(H-3400N，日本)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 磨損顆粒的處理 磨損顆粒選用商品化純鈦顆粒，顆粒直徑小于20 μm。除內(nèi)毒素處理：將鈦顆粒置于烤箱180℃焙烤6 h，浸泡于無水乙醇，離心后棄去上清液，加入PBS液洗滌3遍，最后加入無菌PBS液，將鈦顆粒制成濃度為300 mg/mL的顆粒懸液，用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行內(nèi)毒素含量檢測(cè)。

1.4.2 動(dòng)物模型的建立 小鼠顱骨模型：采用Knocha等的方法建立動(dòng)物模型，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后將小鼠固定于手術(shù)操作臺(tái)上，頭部備皮、碘伏消毒、鋪無菌巾單。沿小鼠顱頂正中矢狀線，切開長約10 mm的皮膚及皮下組織。顯露1 cm×1 cm范圍的骨膜，在骨膜表面注入鈦顆粒懸液0.3 mL(300 mg/mL)，顆粒均勻分布于骨膜表面，縫合切口。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。手術(shù)中所用的器械，均經(jīng)過滅菌處理，整個(gè)操作過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。

小鼠氣囊植骨模型：采用Geng等的方法建立動(dòng)物模型。將小鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，在其背部注射2 mL無菌空氣形成氣囊；之后的6 d內(nèi)，每天向氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，第7天氣囊形成；將顱骨骨片供體組的10只小鼠，頸椎脫臼法處死，及時(shí)取出其顱骨骨片(約0.5 cm×0.4 cm)，剔除多余的軟組織，沿中線均分兩份。將小鼠氣囊植骨模型組20只小鼠麻醉后，背部備皮、消毒、鋪無菌單，切開氣囊，植入顱骨骨片，縫合切口。在植入骨片的氣囊內(nèi)立即注入鈦顆粒懸液0.3 mL(300 mg/mL)。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。手術(shù)中所用的器械，均經(jīng)過滅菌處理，整個(gè)操作過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。

1.4.3 組織標(biāo)本采集 在動(dòng)物模型建立完成后第14天，手術(shù)分別取出小鼠顱骨模型的顱骨骨片和小鼠氣囊植骨模型的顱骨骨片及其包裹在周圍的囊壁組織(界膜)，每個(gè)標(biāo)本均分2份，一份用4%多聚甲醛固定，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和抗石酒酸酸性磷酸酶(TRAP)染色；另一份保存在預(yù)冷的PBS緩沖液中，用于掃描電鏡觀察。

1.5 組織標(biāo)本的處理 將完成固定的組織轉(zhuǎn)至12.5% EDTA脫鈣液中脫鈣處理2周；再將標(biāo)本進(jìn)行脫水、二甲苯透明處理后，進(jìn)行石蠟包埋。將完成包埋的標(biāo)本進(jìn)行4 μm連續(xù)切片；撈片；烤片。

1.6 組織病理學(xué)觀察

1.6.1 蘇木素-伊紅(HE)染色 將烤片取出，常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水處理。蘇木精染色約15min。流水沖洗，沖洗后用1%鹽酸乙醇分色。蒸餾水充分沖洗，然后碳酸鋰飽和水藍(lán)化。再次沖洗后用1%伊紅染色。之后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明等處理。染色完成后，封片，光鏡下觀察。

1.6.2 掃描電子顯微鏡 將獲取的小鼠顱骨標(biāo)本置于2%戊二醛固定2 h后，再用0.1 mmol/L二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次，固定過夜。2%鋨酸固定后，乙醇、叔丁醇逐級(jí)脫水，真空干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察。

1.6.3 抗石酒酸酸性磷酸酶(TRAP)免疫組化染色 嚴(yán)格遵照試劑盒說明書逐步完成，染色完成后，封片，光鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 HE染色后顯示小鼠顱骨模型組顱骨組織表面骨吸收的改變較少，炎性反應(yīng)較輕，有少量的炎性細(xì)胞浸潤，鈦顆粒存留較少；小鼠氣囊植骨模型組植入氣囊內(nèi)的骨塊表面骨吸收現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)炎性反應(yīng)，有大量炎性細(xì)胞浸潤，組織中可見鈦顆粒(見圖1)。

2.2 掃描電鏡結(jié)果 小鼠氣囊植骨模型組顱骨組織表面分布大量的骨吸收凹陷，數(shù)量較多，大小不一，形狀不規(guī)則；同時(shí)部分凹陷處有鈦顆粒的浸入。采用圖像分析儀對(duì)骨吸收面積進(jìn)行采集，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下，小鼠氣囊植骨模型組骨吸收面積(385.30±5.11)nm2，明顯高于小鼠顱骨模型組(288.60±4.89)nm2(P<0.05，見圖2)。

2.3 TRAP染色結(jié)果 TRAP染色后陽性結(jié)果示破骨細(xì)胞為酒紅色。兩組比較顯示小鼠顱骨模型組破骨細(xì)胞數(shù)目明顯較少且鈦顆粒分布，而小鼠氣囊植骨模型組破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多(見圖3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下，小鼠氣囊植骨模型組破骨細(xì)胞數(shù)目(16.75±0.53)個(gè)，明顯高于小鼠顱骨模型組(9.55±0.48)個(gè)(P<0.05)。

注：紅色箭頭標(biāo)記為鈦顆粒，綠色箭頭標(biāo)記為炎性細(xì)胞 注：紅色箭頭標(biāo)記為鈦顆粒，黃色箭頭標(biāo)記為骨溶解凹陷 注：紅色箭頭標(biāo)記為鈦顆粒，白色箭頭標(biāo)記為破骨細(xì)胞，在TRAP染色中破骨細(xì)胞被染成紅褐色

圖1 兩種磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型HE染色(×20) 圖2 兩種磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型掃描電鏡(×1 000) 圖3 兩種磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型TRAP染色(×20)

3 討 論

自20世紀(jì)60年代以來，探尋一種能夠完整模擬磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的動(dòng)物模型，一直是眾多學(xué)者的研究方向。各國學(xué)者先后建立了多種動(dòng)物模型(兔模型、羊模型、犬模型等)，但均存在不足因素。目前，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用最為普遍的動(dòng)物模型主要有兩種，分別是小鼠顱骨模型和小鼠植骨氣囊模型，兩種模型均屬于磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的病理模型。Pajarinen等人[4]指出小鼠顱骨模型在模擬骨、界膜和磨損顆粒之間假體周圍微環(huán)境存在不足，也有學(xué)者[5-6]指出小鼠氣囊植骨模型中植入的骨片缺少血供，植入14d后游離鈣離子和退變骨膠質(zhì)含量增加，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但哪種能夠準(zhǔn)確地模擬磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的病理學(xué)機(jī)制？依然存在爭議。

隨著人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍骨溶解相關(guān)研究的不斷深入和開展，假體周圍骨溶解是一個(gè)長期的慢性炎癥反應(yīng)過程[7]。在這過程中磨損顆粒刺激炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生起到了至關(guān)重要的作用[8-10]。同時(shí)早在20世紀(jì)90年代Granchi等人[11]研究指出在人工假體周圍存在界膜組織，其主要為纖維結(jié)締組織，能夠產(chǎn)生釋放多種炎性介質(zhì)并在假體周圍骨溶解中發(fā)揮促進(jìn)作用。近年來多項(xiàng)研究同樣證實(shí)了上述觀點(diǎn)[12-15]。小鼠氣囊植骨模型通過在小鼠背部建立氣囊結(jié)構(gòu)，能夠模擬假體周圍的界膜組織，彌補(bǔ)了其他動(dòng)物模型(小鼠顱骨模型缺少假體周圍組織的微環(huán)境[4])的不足之處，通過本實(shí)驗(yàn)研究也得以驗(yàn)證。在小鼠氣囊植骨模型中，由于采用同基因小鼠的顱骨作為植骨材料有效地避免了組織排斥反應(yīng)。術(shù)后2周取材避免了游離鈣離子和退變骨膠質(zhì)含量增加對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。取材后肉眼觀察發(fā)現(xiàn)在鈦顆粒的刺激下植入顱骨骨片與周圍氣囊組織之間存在明顯的炎性反應(yīng)，周圍明顯紅腫、伴有新生血管的形成，這與人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)中見到的關(guān)節(jié)界膜組織的炎性表現(xiàn)相似。同時(shí)通過免疫組織化學(xué)法和掃描式電子顯微鏡等技術(shù)對(duì)兩種動(dòng)物模型進(jìn)行了比較研究。比較結(jié)果顯示，在炎癥反應(yīng)、骨溶解面積以及破骨細(xì)胞數(shù)目這三項(xiàng)主要指標(biāo)上，小鼠氣囊植骨模型組相對(duì)小鼠顱骨模型組具有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，小鼠氣囊植骨模型首先具有更好的模擬性，本動(dòng)物模型不但可以模擬出磨損顆粒刺激產(chǎn)生的界膜組織，而且可以產(chǎn)生磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解反應(yīng)。此外該模型能夠?qū)侨芙饧澳冶诘难装Y情況等進(jìn)行定性定量研究，具有科學(xué)實(shí)用性。該動(dòng)物模型操作簡單，費(fèi)用低廉，具有廣泛適用性。在模擬磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解病理過程中小鼠氣囊植骨模型模擬度更高。