翁嘉慧，樓億圓，徐京，何軍光*，張曉麗，劉永立

（1.浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司，杭州311600；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州310058）

大豆（Glycine maxL.）起源于我國，是我國重要的糧食作物之一。1982 年我國的大豆出口量達(dá)到全球出口份額的90%[1]。而自從1996年，美國孟山都公司成功地培育出耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆[2]后，耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆在美國、阿根廷、巴西等國快速普及，其種植面積迅速擴(kuò)大。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA）公布的數(shù)據(jù)，2017年全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積達(dá)到9 410萬hm2，約占轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的一半，且其耐除草劑性狀一直占主導(dǎo)地位[3]。大量質(zhì)優(yōu)而價(jià)廉的轉(zhuǎn)基因大豆涌入國際市場(chǎng)，對(duì)我國的非轉(zhuǎn)基因大豆造成了巨大的沖擊[4]，導(dǎo)致我國由大豆第一出口國變成第一進(jìn)口國[5]。根據(jù)中國海關(guān)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，2017年，我國大豆總需求量達(dá)到1.107 9 億t，其中約有86%依賴于進(jìn)口。一旦大豆出口國遭遇大的自然災(zāi)害或調(diào)整貿(mào)易政策，我國進(jìn)口大豆的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)很大[6]。因此，培育耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆品種、擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積，是我國實(shí)現(xiàn)大豆供需平衡、保證糧食安全的有效手段之一[7]。

耐除草劑的功能基因主要為Pat（Bar）和EPSPS。根據(jù)ISAAA公布的數(shù)據(jù)，商業(yè)化程度最高的2 個(gè)大豆品系GTS-40-3-2、NK603 均含有來自cp4菌株的EPSPS耐草甘膦基因。草甘膦作為除草劑，具有良好的內(nèi)吸收性和低毒性，且對(duì)人（Homo sapiens）和動(dòng)物基本沒有毒性[8]，是培育耐除草劑作物的優(yōu)良靶標(biāo)除草劑。CP4-EPSPS基因是孟山都公司克隆的，并在1994 年申請(qǐng)了相關(guān)專利，專利號(hào)為US5633435，已于2014 年過期。AM79-EPSPS基因由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院林敏的科研團(tuán)隊(duì)通過實(shí)驗(yàn)獲得[9]，專利號(hào)為CN200710177090.1，是具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新基因。該基因編碼的蛋白屬于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS），是一種全新的EPSPS 蛋白[10]。動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，AM79-EPSPS 蛋白不僅具有較高的草甘膦耐受性，而且保持著與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate,PEP）較強(qiáng)的親和性，能夠賦予植物對(duì)除草劑草甘膦的耐受性，是培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的極佳選擇。REN 等[11]發(fā)現(xiàn)，AM79-EPSPS基因可以用于培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米（Zea maysL.），且其在轉(zhuǎn)基因玉米中過表達(dá)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)草甘膦的抗性。但到目前為止，尚未有AM79-EPSPS在轉(zhuǎn)基因大豆中表達(dá)研究的報(bào)道。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法培育轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因耐草甘膦大豆新品種，通過對(duì)其中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行研究，建立高效的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆轉(zhuǎn)化體系，從而獲得轉(zhuǎn)化體，并驗(yàn)證其對(duì)草甘膦的耐受性，旨在為培育具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定基礎(chǔ)，以提高我國大豆產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 大豆受體材料

天隆一號(hào)大豆品種，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 菌株及載體

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法培育耐草甘膦大豆新品種，所用農(nóng)桿菌菌株為EHA 105，具有利福平抗性（rifampicin-resistent, Rif），大腸埃希菌菌株為DH5a，無抗性。所用載體為AM79-pC3301，其圖譜如圖1所示。該載體只含有一個(gè)目的基因表達(dá)盒（AM79-EPSPS基因），不含標(biāo)記基因和報(bào)告基因。骨架載體為pCAMBIA3301，來源于農(nóng)桿菌，該載體在國際上已使用多年，沒有致病性，也不可能演變?yōu)橛兄虏⌒浴?/p>

1.1.3 試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)所使用的主要試劑有胰蛋白胨、酵母提取物（英國OXOID公司），利福平、羧芐西林、肌醇、瓊脂粉、卡那霉素（Kanamycin, Kan）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，替卡西林（Ticarcillin, Ti）（杭州南啟生物科技有限公司），蔗糖、6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine, 6-BA）、有機(jī)緩沖劑2-（N-嗎啉）乙醇磺酸[2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid,MES]、赤霉素（gibberellic acid,GA3）、L-谷氨酸（L-glutamine,L-Glu）、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）、α-硫辛酸（α-lipoic acid, LA）、反式玉米素（trans-zeatin, ZT）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid,IBA）、乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，植物凝膠、草甘膦粉劑、41%草甘膦異丙胺鹽水劑（浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司）等。

圖1 AM79-pC3301載體圖譜Fig.1 Carrier map of AM79-pC3301

實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器有接種器械滅菌器（北京金博藍(lán)河科技有限公司），超凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），滅菌鍋[致微（廈門）有限公司]，搖床（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），離心機(jī)（德國Eppendorf公司），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（德國Biometra 公司），電熱恒溫水槽、凝膠電泳儀、恒溫箱、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國UVP 公司），高通量組織研磨儀（浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司），分析天平（德國賽多利斯公司），pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆，該方法主要在PAZ 等[12]提出的轉(zhuǎn)化方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化過程中大豆種子消毒時(shí)間、侵染及共培養(yǎng)所使用的AS濃度、篩選過程中草甘膦濃度和生根階段IBA浸沒時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了探究，從而建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)化體。

1.2.1 大豆種子消毒時(shí)間的確定

挑選種皮無裂痕且飽滿的干豆平鋪在無菌培養(yǎng)皿中，然后放入密封狀態(tài)良好的干燥器中（培養(yǎng)皿開蓋放置，將培養(yǎng)皿蓋一并豎放在干燥器內(nèi)）；取70 mL次氯酸鈉溶液于100 mL小燒杯中，并將它放入干燥器內(nèi)，然后用移液槍取3 mL濃鹽酸于小燒杯中，并迅速蓋好干燥器的蓋子，密閉消毒0、4、6、8、10、12、24 h 后，接種至預(yù)培養(yǎng)的G1 培養(yǎng)基[其組成為：MS 基本培養(yǎng)基（MS 大量、微量、微微量，B5 有機(jī)、鐵鹽）+6-BA 2 mg/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠3.0 g/L]上，接種3 d 后，統(tǒng)計(jì)大豆種子的萌發(fā)率和污染率。每個(gè)處理選用50顆大豆種子，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 大豆外植體制備

干豆滅菌結(jié)束后，將其接種在G1培養(yǎng)基上，見光預(yù)培養(yǎng)18～24 h。挑取無菌、活性好的萌發(fā)豆置于無菌瓶中，浸泡2～4 h后，倒掉無菌水，用無菌濾紙吸去多余水分，并用解剖刀從種臍處對(duì)半切開，去掉種皮，切掉2/3 下胚軸，并切去一半子葉，留下帶有胚的一半置于無菌瓶中，備用。

1.2.3 農(nóng)桿菌菌液制備

轉(zhuǎn)化前一天在YEP液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/L和Kam 50 mg/L）中添加菌液，進(jìn)行活化和擴(kuò)增，然后在28 ℃、180 r/min 搖床上暗培養(yǎng)15～17 h，接著以5 000 r/min 離心10 min，收集菌體，倒掉上層清液，用浸染液G2液體培養(yǎng)基（其組成為：1/10 MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2 mg/L+蔗糖30 g/L+MES 4 g/L+GA30.25 mg/L+LA 25 mg/L+AS）重懸菌體，備用。

1.2.4 草甘膦添加濃度的確定

將1.2.2 中制備好的豆瓣用不含激素及農(nóng)桿菌的浸染液浸沒，常溫下放置30 min，每隔10 min 搖一搖，倒掉液體，取出豆瓣，吸去多余的液體，然后將其接種在共培養(yǎng)基G2 固體培養(yǎng)基（G2 液體培養(yǎng)基加瓊脂粉12 g/L）上，在培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙。共培養(yǎng)結(jié)束后，將子葉節(jié)接種到以草甘膦為篩選劑的篩選培養(yǎng)基G3[其組成為：MS基本培養(yǎng)基+MES 0.59 g/L+6-BA 1.11 mg/L+蔗糖30 g/L+草甘膦（由草甘膦粉劑配制）+植物凝膠3.0 g/L]上，同時(shí)誘導(dǎo)叢生芽，設(shè)置7 個(gè)不同的草甘膦濃度（0、40、60、80、100、200、500 μmol/L），3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理49個(gè)外植體。見光培養(yǎng)14～15 d 以進(jìn)行第1 輪篩選，結(jié)束后，將子葉節(jié)取出并切除長(zhǎng)勢(shì)過于茂盛的芽，移入新鮮的G3培養(yǎng)基上進(jìn)行第2輪篩選，共培養(yǎng)14～15 d。在第2輪篩選完成后，統(tǒng)計(jì)出芽率，并將長(zhǎng)出叢生芽的外植體轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基G4（其組成為：MS基本培養(yǎng)基+MES 0.59 g/L+谷氨酰胺0.1 g/L+天門冬酰胺0.05 g/L+蔗糖30 g/L+復(fù)方替卡西林270 mg/L+IAA 0.1 mg/L+玉米素1 mg/L+GA30.5 mg/L+植物凝膠3.0 g/L）中，培養(yǎng)1～2 個(gè)月，統(tǒng)計(jì)芽伸長(zhǎng)率，其中每隔14～15 d換一次新鮮的培養(yǎng)基。

1.2.5 AS 添加濃度的確定

將1.2.2中制備好的豆瓣用重懸液浸沒，常溫下放置30 min，每隔10 min搖一搖，倒掉菌液，將豆瓣取出，置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，吸掉多余的菌液，然后將豆瓣接種在共培養(yǎng)基G2 固體培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙）。共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入含草甘膦的篩選培養(yǎng)基G3中培養(yǎng)28～30 d后，統(tǒng)計(jì)出芽率，并將長(zhǎng)出叢生芽的外植體轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基G4中，培養(yǎng)1～2個(gè)月，統(tǒng)計(jì)芽伸長(zhǎng)率，其中每隔14～15 d 換一次新鮮的培養(yǎng)基。設(shè)置7 個(gè)不同的AS 濃度（0、50、100、150、200、250、300 μmol/L），3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理49 個(gè)外植體，于23 ℃暗培養(yǎng)3 d 后，考察AS濃度對(duì)大豆外植體出芽率和芽伸長(zhǎng)率的影響。

1.2.6 IBA 浸沒時(shí)間的確定

待芽伸長(zhǎng)至2～3 cm后，將芽從基部切下，在其基部蘸1 mg/mL IBA溶液，然后插入生根培養(yǎng)基G5（其組成為：MS 基本培養(yǎng)基+MES 0.3 g/L+蔗糖20 g/L+植物凝膠3.0 g/L）中進(jìn)行生根培養(yǎng)。設(shè)置7 個(gè)不同的浸沒時(shí)間（0、30、60、120、180、300、600 s），3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理10 株，15 d 后統(tǒng)計(jì)浸沒時(shí)間對(duì)不定芽生根率的影響。

1.2.7 再生苗煉苗及移栽

待再生苗長(zhǎng)出3 條以上根系后進(jìn)行移栽，先煉苗2～3 d，然后選用杭州錦海農(nóng)業(yè)科技有限公司育苗基質(zhì)，將幼苗根部培養(yǎng)基洗凈，用薄層育苗基質(zhì)覆蓋在根部，周邊澆水至浸透，套袋培養(yǎng)2～3 d后，撤去袋子，于弱光處放置1 d后，隔天放于強(qiáng)光下培養(yǎng)。

1.2.8 再生苗基因組DNA 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

移栽成活后的幼苗在1 周左右長(zhǎng)出新葉，取1片新葉作為檢測(cè)材料，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB）法提取大豆幼苗葉片的基因組DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）鑒定。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：基因組DNA 1.0 μL；2×master mix（杭州擎科生物科技有限公司）10.0 μL；AM79-EPSPS-F 0.5 μL；AM79-EPSPS-R 0.5 μL；ddH2O 8.0 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)的引物序列如下。AM79-EPSPS-F：5′-CTGTGACAACAGT CAGCCGT-3′；AM79-EPSPS-R：5′-GGTGTTCCG TCAGGTACTCG-3′。

1.2.9 陽性植株AM79-EPSPS 蛋白表達(dá)檢測(cè)

為了排除假陽性及驗(yàn)證AM79-EPSPS基因的表達(dá)情況，對(duì)PCR 檢測(cè)陽性的植株按照AM79-EPSPS轉(zhuǎn)基因速測(cè)試紙說明書（上海佑隆生物科技有限公司）檢測(cè)AM79-EPSPS蛋白表達(dá)情況。

1.2.10 轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株抗性測(cè)試

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株對(duì)草甘膦的抗性，在其T0代陽性苗移栽成活后2 周，對(duì)其進(jìn)行1 倍濃度（普通大田除草劑使用濃度）的41%草甘膦異丙胺鹽水劑噴施處理，以未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的再生苗作為陰性對(duì)照。噴施2 周后統(tǒng)計(jì)存活率，并將存活的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆種植于人工氣候室內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至收種。收獲各轉(zhuǎn)化體T1代轉(zhuǎn)基因大豆種子后，于溫室內(nèi)各播種一定量的T1代轉(zhuǎn)基因大豆種子及野生型天隆一號(hào)大豆種子（對(duì)照），待其長(zhǎng)出葉片，按照1.2.8 和1.2.9的方法分別進(jìn)行再生苗基因組DNA 的PCR 鑒定和陽性植株AM79-EPSPS 蛋白表達(dá)檢測(cè)，繼續(xù)長(zhǎng)至第二復(fù)葉期時(shí)，噴施1 倍濃度的41%草甘膦異丙胺鹽水劑，2 周后統(tǒng)計(jì)存活率。收獲T2代轉(zhuǎn)基因大豆種子后，重復(fù)以上步驟收獲各轉(zhuǎn)化體T1代轉(zhuǎn)基因大豆種子。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆種子消毒時(shí)間的確定分析

利用氯氣消毒法對(duì)大豆種子進(jìn)行消毒，通過在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，考察不同消毒時(shí)間對(duì)大豆種子污染率和萌發(fā)率的影響，結(jié)果如表1 所示。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆種子的污染率降低，消毒時(shí)間超過6 h后，大豆種子的污染率差異不顯著，均趨近于0。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，過長(zhǎng)的消毒時(shí)間會(huì)抑制大豆種子的萌發(fā)，超過8 h后，大豆種子萌發(fā)率顯著降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇6～8 h作為最佳的消毒時(shí)間。

表1 不同消毒時(shí)間下大豆種子的污染率和萌發(fā)率Table 1 Pollution and germination rates of soybean seeds under different disinfection time

2.2 草甘膦添加濃度的確定分析

本實(shí)驗(yàn)研究了7個(gè)不同的草甘膦濃度對(duì)大豆外植體出芽率和芽伸長(zhǎng)率的影響。如圖2 所示：當(dāng)草甘膦濃度為0 μmol/L 時(shí)，大豆叢生芽生長(zhǎng)茂盛，隨著草甘膦濃度的升高，叢生芽生長(zhǎng)受抑制程度愈來愈大，且子葉節(jié)在草甘膦的作用下開始腐爛；當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到200 μmol/L 時(shí)，出芽已經(jīng)十分困難，且生長(zhǎng)狀態(tài)不佳；當(dāng)草甘膦濃度為500 μmol/L 時(shí)，已經(jīng)無叢生芽長(zhǎng)出。同時(shí)，如表2所示：當(dāng)草甘膦濃度為100 μmol/L 時(shí)，出芽率明顯降低，但仍有10.87%叢生芽伸長(zhǎng)；當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，雖然還有9.5%的叢生芽長(zhǎng)出，但都不能伸長(zhǎng)。故本實(shí)驗(yàn)選擇100 μmol/L草甘膦作為篩選壓。

圖2 不同草甘膦濃度對(duì)大豆外植體出芽率和芽伸長(zhǎng)率的影響Fig.2 Effects of different glyphosate concentrations on buddingand bud elongation rates of soybean explants

2.3 AS 添加濃度的確定分析

不同濃度AS對(duì)轉(zhuǎn)化過程中大豆外植體的出芽率和芽伸長(zhǎng)率的影響如表3所示。當(dāng)共培養(yǎng)階段不添加AS時(shí)，轉(zhuǎn)化率幾乎為0，說明AS在決定外源基因能否導(dǎo)入受體細(xì)胞中起到了關(guān)鍵性作用；當(dāng)AS濃度為150～200 μmol/L 時(shí)，出芽率及芽伸長(zhǎng)率較為理想，在這個(gè)范圍內(nèi)大豆外植體的出芽率為40%左右；當(dāng)AS 濃度高于200 μmol/L 時(shí)，出芽率降低，說明過高的AS 濃度反而起到了抑制作用。同時(shí)，考察抗性芽后期的伸長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)：AS濃度在100～200 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，出芽率之間雖然差異不顯著，但是當(dāng)AS濃度為200 μmol/L時(shí)，芽伸長(zhǎng)率最高，達(dá)到了14.30%。故本實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol/L 作為最佳的AS添加濃度。

表2 不同草甘膦濃度下大豆外植體出芽率和芽伸長(zhǎng)率Table 2 Budding and bud elongation rates of soybean explants under different glyphosate concentrations

表3 不同AS濃度下大豆外植體出芽率和芽伸長(zhǎng)率Table 3 Budding and bud elongation rates of soybean explants under different AS concentrations

2.4 IBA 浸沒時(shí)間的確定分析

本研究考察了浸沒在1 mg/mL IBA溶液中不同時(shí)間對(duì)再生苗生根率的影響。結(jié)果（表4）顯示，在不使用IBA 的情況下，生根十分困難，而使用IBA后，較短的浸沒時(shí)間有助于提高轉(zhuǎn)基因再生苗的生根率，最高可達(dá)96.67%，但當(dāng)浸沒時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，IBA會(huì)抑制再生苗的生根。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在IBA中浸沒時(shí)間為30 s。

表4 不同IBA浸沒時(shí)間下再生苗的生根率Table 4 Rooting rate of regenerated seedlings under different IBA immersion time

2.5 再生苗基因組DNA 的PCR 檢測(cè)結(jié)果分析

通過轉(zhuǎn)化獲得9 株長(zhǎng)勢(shì)較好的抗性苗，移栽成活后采用PCR 方法檢測(cè)外源基因是否插入到大豆基因組DNA 中。結(jié)果（圖3）顯示，在事件A1～A9中，除A1、A4、A5外，其余事件均能夠擴(kuò)增到目標(biāo)片段，而AM79-EPSPS基因目標(biāo)條帶大小為645 bp，說明外源基因已經(jīng)整合到這6株大豆的基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆再生苗基因組DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of PCR for genomic DNA of regenerated transgenic soybean seedlings

圖4 T0代陽性植株AM79-EPSPS蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of AM79-EPSPS protein expressionin T0 generation positive plants

2.7 轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株抗性測(cè)試結(jié)果分析

通過噴施1倍濃度的41%草甘膦異丙胺鹽水劑對(duì)轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株進(jìn)行抗性驗(yàn)證，結(jié)果如圖5 所示。6 株T0代轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株在噴施草甘膦2 周后均能正常生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)基因大豆植株已經(jīng)枯萎。如表5 所示，這6 個(gè)轉(zhuǎn)化體的T0、T1、T2代植株在噴施草甘膦2 周后，轉(zhuǎn)化體的存活率均為100%，而非轉(zhuǎn)基因大豆植株（對(duì)照）的存活率均為0。說明轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株具有明顯的草甘膦抗性且能將此特性正常遺傳給后代。

圖5 T0代轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株抗性測(cè)試結(jié)果Fig.5 Resistance test results of T0 generation transgenic soybeanplants transformed by AM79-EPSPS gene

表5 T0～T2代轉(zhuǎn)基因大豆植株噴施草甘膦后存活率統(tǒng)計(jì)Table 5 Survival rate statistics of T0-T2 generation transgenic plants sprayed with glyphosate

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)AM79-EPSPS 基因大豆轉(zhuǎn)化體系的建立

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在大豆轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟，然而同一作物，導(dǎo)入的基因不同，其轉(zhuǎn)化條件也存在差異[13]，AM79-EPSPS在大豆轉(zhuǎn)化中為一個(gè)新型的抗草甘膦基因，對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行研究，對(duì)于轉(zhuǎn)化體系的成功建立有著至關(guān)重要的作用[14]。本研究分別從大豆種子消毒時(shí)間、侵染時(shí)使用的AS 濃度、篩選劑草甘膦濃度和生根階段IBA浸沒時(shí)間等因素出發(fā)，探究并建立了高效的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆轉(zhuǎn)化體系。

杜升偉等[15]、劉銀[16]、李冬梅等[17]都證明了氯氣消毒法可以有效地進(jìn)行大豆種子消毒。孫昕等[18]研究表明，大豆種子氯氣熏蒸時(shí)間為6～10 h時(shí)，種子的污染率和萌發(fā)率控制得最好；而白肖飛[19]驗(yàn)證了氯氣熏蒸16 h 時(shí)大豆種子的消毒效果最佳；翟銳等[20]則報(bào)道了氯氣熏蒸14～18 h，可在不影響大豆種子活力的同時(shí)最大限度地減少污染。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果稍有出入，這可能與大豆種子本身的質(zhì)量及其品種有關(guān)。

建立高效的耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆體系，選擇合適的篩選濃度對(duì)獲取陽性苗有著舉足輕重的作用[21]。王婉婉[22]研究表明，以草甘膦作為篩選劑進(jìn)行大豆轉(zhuǎn)化時(shí)，草甘膦質(zhì)量濃度以10～15 mg/L 為宜。陸玲鴻等[23]在進(jìn)行草甘膦濃度梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)草甘膦質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，雖然叢生芽的再生率下降了50%～60%，但最終轉(zhuǎn)化效率不受影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此基本相符。

AS是影響苦豆子[24]、棉花[25]、白楊[26]等多種植物轉(zhuǎn)化率的主要因素。柯丹霞等[27]對(duì)大豆轉(zhuǎn)化過程中AS 濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)AS 濃度為100 μmol/L 時(shí)其叢生芽的誘導(dǎo)率最高。而皮照興等[28]、LIU 等[29]的研究結(jié)果表明，在共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中添加200 μmol/L AS 最有利于轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。

生根是外植體再生過程中的一個(gè)關(guān)鍵性步驟。謝璐遙[30]、代兵兵[31]研究表明，將大豆再生苗基部蘸1 mg/mL IBA 溶液能夠促進(jìn)生根，廖人燕等[32]研究發(fā)現(xiàn)，不同IBA浸泡時(shí)間對(duì)金錢草水插生根的影響不同。說明不同的IBA 浸沒時(shí)間對(duì)于生根的影響亦不一樣。趙迪[33]研究表明，將伸長(zhǎng)至3～5 cm 的大豆再生芽蘸1 min IBA 后移入生根培養(yǎng)基中，能促進(jìn)大豆順利地生根；韓強(qiáng)[34]在大豆芽伸長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)，將其切下，將幼芽底部浸泡在IBA中30 s～l min，然后插入生根培養(yǎng)基中促進(jìn)其生根?？梢钥闯?，上述研究選用的IBA 浸沒時(shí)間都較短，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。

3.2 轉(zhuǎn)AM79-EPSPS 基因大豆植株的功能驗(yàn)證

郭文芳等[35]在研究轉(zhuǎn)基因棉花時(shí)發(fā)現(xiàn)，試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確性高于PCR鑒定和草甘膦測(cè)試，并建議將草甘膦和試紙條結(jié)合使用。李太強(qiáng)等[36]在研究轉(zhuǎn)基因小麥時(shí)發(fā)現(xiàn)，試紙條檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確，但成本較高。本研究使用試紙條、PCR 和草甘膦3 種檢測(cè)方法驗(yàn)證了AM79-EPSPS基因已經(jīng)導(dǎo)入到6株大豆植株中。

本研究采用普通大田草甘膦使用濃度噴施T0、T1、T2代轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因大豆植株，對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在本次實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因T0代大豆植株在噴施草甘膦后能正常生長(zhǎng)，說明其已具備草甘膦抗性，且受外界因素影響較?。黄銽1、T2代植株在噴施草甘膦后也均能正常生長(zhǎng)；而各世代非轉(zhuǎn)基因大豆植株全部死亡。這充分說明AM79-EPSPS基因能賦予轉(zhuǎn)基因大豆明顯的草甘膦耐受性。

4 結(jié)論

本研究對(duì)轉(zhuǎn)化過程中大豆種子消毒時(shí)間、侵染及共培養(yǎng)所使用的AS 濃度、篩選過程中草甘膦濃度和生根階段IBA 浸沒時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了探究，明確了當(dāng)種子消毒時(shí)間為6～8 h，AS 濃度為200 μmol/L，草甘膦濃度為100 μmol/L，IBA 浸沒時(shí)間為30 s 時(shí)，轉(zhuǎn)化效果最好。本研究建立了高效的轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆轉(zhuǎn)化體系。根據(jù)建立的轉(zhuǎn)化體系開展了一批轉(zhuǎn)化，獲得的6 株轉(zhuǎn)AM79-EPSPS基因大豆苗在T0、T1、T2代都能檢測(cè)到AM79-EPSPS 蛋白表達(dá)，且都表現(xiàn)出明顯的草甘膦耐受性，證明該轉(zhuǎn)化體系是有效的，也說明AM79-EPSPS基因可以用來培育耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆。AM79-EPSPS在轉(zhuǎn)基因大豆中的分子特征及在后代中賦予轉(zhuǎn)基因大豆高倍草甘膦耐受性的機(jī)制等還需進(jìn)一步研究?？傊?，本研究為新基因的功能研究搭建了橋梁，為培育具有國家自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定了基礎(chǔ)，對(duì)推動(dòng)我國生物種業(yè)這一戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了關(guān)鍵性的作用，對(duì)保障國家糧食安全和國家農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。