張雙艷，孟靜，韓洋琳，吳紅芝

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明650201）

月季（Rosa hybridaL.）屬于薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，以其品種多、花色艷、形態(tài)美、花期長(zhǎng)等特點(diǎn)深受人們喜愛，有“花中皇后”的美稱。月季切花居世界五大切花之首，其盆花和綠籬的應(yīng)用也十分流行，同時(shí)也是多種高級(jí)食品、化妝品的重要香料原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。切花作為月季的主要產(chǎn)品形式，其采后品質(zhì)直接決定了月季的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，隨著月季種植面積的擴(kuò)大和溫室大棚月季的大量增長(zhǎng)，月季病害日益嚴(yán)重，成為影響月季采后品質(zhì)的重要因素。其中灰霉病是月季生產(chǎn)中常見且危害較嚴(yán)重的一種真菌性病害，花、葉、莖均可發(fā)病，由于其在低溫高濕條件下生存與繁殖力很強(qiáng)[1]，已成為月季采后最嚴(yán)重的病害，被稱為月季切花采后的“癌癥”。

灰霉病是由葡萄孢屬真菌（Botrytisspp．）引起的死體營養(yǎng)型真菌病害，其病原菌是一種兼性寄生病菌，屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗叢梗孢科、葡萄孢屬[1]?；颐共∈锹兜?、保護(hù)地作物中常見的一種真菌性病害。當(dāng)溫度和濕度適宜時(shí)，寄主植物表面的分生孢子萌發(fā)長(zhǎng)出芽管并分化發(fā)育成菌絲，通過氣孔和傷口或分泌一些細(xì)胞壁降解酶穿過寄主表皮，進(jìn)入寄主組織，引起組織軟化、腐爛，后期在寄主表面產(chǎn)生大量的無性分生孢子進(jìn)行再次侵染[2-3]，也可以通過產(chǎn)生一系列不同的毒素來降低植物抵抗感染的能力，以達(dá)到侵染的目的[4]。在惡劣的條件下，大量的菌絲體相互扭結(jié)，形成表皮比較堅(jiān)硬的菌核，可抵御不利的生存環(huán)境，一旦條件適宜，便能直接產(chǎn)出分生孢子，恢復(fù)感染周期，在灰霉病的病害循環(huán)中起重要作用[5]。

云南是中國70%以上月季切花的生產(chǎn)基地，也是全球重要的月季切花生產(chǎn)地，該地區(qū)栽培月季的時(shí)間長(zhǎng)、規(guī)模大、種類豐富，為月季灰霉病的發(fā)生和不同病菌的生存提供了良好的條件。從昆明花拍中心和云南地區(qū)月季種植農(nóng)戶處調(diào)查得知，灰霉病對(duì)月季切花采后造成嚴(yán)重危害，直接影響了月季切花的采后品質(zhì)和價(jià)格，月季灰霉病成為花拍中心和月季種植戶亟待解決的問題。但關(guān)于云南地區(qū)月季灰霉病的研究尚未見報(bào)道；因此，本研究從云南18個(gè)月季切花產(chǎn)區(qū)采集月季灰霉病樣本，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察和現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)病原分離物進(jìn)行鑒定，以確定引起云南地區(qū)月季灰霉病的病原菌種類和特征，研究結(jié)果可為月季灰霉病的防治提供重要支撐。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集和病原菌的分離與純化

從云南18 個(gè)月季切花生產(chǎn)基地采集帶有典型灰霉病病斑的月季花瓣、葉或嫩莖，裝在自封袋里，標(biāo)上切花品種、采集日期和采集地，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在4 ℃冰箱中，待分離。用澆注平板法對(duì)采集的病樣進(jìn)行分離、純化[6-7]。切取病樣發(fā)病部位放入5 mL 離心管中，加入2 mL 無菌水，充分振蕩，然后按1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6濃度梯度稀釋，取1×10－4、1×10－5、1×10－6菌液各200 μL注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后倒入15～20 mL 冷卻至45～50 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基，水平搖晃均勻，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將接種好的培養(yǎng)皿倒置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，將獲得的分離物多次純化后得到目標(biāo)菌株。在超凈工作臺(tái)上用直徑6 mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣打取菌餅，放入裝有1.8 mL 20%甘油的凍干管中，每管保存3個(gè)菌餅，于4 ℃冰箱中保存24 h 后，再放入－20 ℃冰箱中凍藏，待凝固后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱中保存[8]。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d后，用直徑6 mm 的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到新的PDA 中，每皿1 個(gè)菌餅，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，分別測(cè)量24 h和48 h菌落的直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，觀察菌落的形狀、顏色及菌核和分生孢子的產(chǎn)生等，15 d 后計(jì)算菌核產(chǎn)量和測(cè)量菌核直徑。菌絲生長(zhǎng)速度=（48 h菌落直徑－24 h菌落直徑）/2。

菌株的顯微特征觀察采用蓋玻片插片培養(yǎng)法[9]。將病原菌制成孢子懸浮液，用澆注平板法將菌液接種在培養(yǎng)皿中，然后將滅過菌的蓋玻片按約45 ℃角斜插在凝固的培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d 后，用鑷子將蓋玻片取下，放置在載玻片上，置于顯微鏡下觀察。

1.3 病原菌的分子鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)的多樣性，結(jié)合樣本來源，從每個(gè)月季切花產(chǎn)區(qū)選擇4～6個(gè)代表菌株共88個(gè)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將保存的代表菌株在PDA上20 ℃活化培養(yǎng)6～8 d后刮取菌絲，用液氮充分研磨，然后用Hipure 真菌DNA 迷你試劑盒（美基生物科技有限公司）提取DNA。對(duì)代表菌株的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、依賴RNA 的DNA 聚合酶Ⅱ亞基基因RPB2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增和測(cè)序，引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由昆明碩擎生物科技有限公司完成。引物序列信息見表1。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）[12]：2×RapidTaq預(yù)混液12.5 μL，正、反向引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。PCR 反應(yīng)程序[12]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃（ITS）或56 ℃（RPB2）退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，用Geneious 8.0 軟件對(duì)自測(cè)序列和從GenBank 上下載的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)和修飾，用SequenceMatrix-Windows-1.8 軟件對(duì)2 段基因序列進(jìn)行拼接處理。以核盤菌屬（Sclerotinia sclertiorum）和 叢 梗 孢 屬（Monilinia fructicola）作為外群，通過MEGA 7.0 軟件，利用鄰接法進(jìn)行聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，自展支持率分析采用1 000次重復(fù)。

表1 引物序列信息Table1 Information of primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 云南地區(qū)月季灰霉病的癥狀

月季灰霉病在月季生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期均可發(fā)生，云南地區(qū)每年3—4 月天氣轉(zhuǎn)暖和8—10 月雨季時(shí)是月季灰霉病的高發(fā)期，莖、葉、花均可發(fā)病，其中花瓣發(fā)病最為嚴(yán)重。嫩莖和花蕾受侵染時(shí)，病斑呈黑褐色，阻止嫩莖生長(zhǎng)和花蕾開放，最后整個(gè)受侵部位變褐枯死。當(dāng)侵害葉片時(shí)，在葉緣或葉尖處往往出現(xiàn)暗綠色水漬狀斑塊（如開水燙傷），并不斷向葉內(nèi)擴(kuò)展直至腐爛?；ò瓯磺秩境跗?，部分花瓣出現(xiàn)玫紅色、褐色或白色斑點(diǎn)（隨月季品種而不同），然后斑點(diǎn)進(jìn)一步擴(kuò)大，漸漸變成水漬狀或變褐皺縮、腐敗（圖1）。在溫暖潮濕的環(huán)境下，灰色霉層即分生孢子可以完全長(zhǎng)滿受侵染部位。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

本實(shí)驗(yàn)從云南昆陽、晉寧、安寧、石林、彌勒等地的18 個(gè)月季切花產(chǎn)區(qū)月季上采集了206 個(gè)灰霉病樣，根據(jù)菌落形態(tài)特征、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)，分離到124個(gè)灰霉病病原菌。

如圖2 所示，病原菌在PDA 培養(yǎng)基上20 ℃恒溫、黑暗培養(yǎng)15 d后，菌落特征表現(xiàn)出明顯的差異，根據(jù)菌落形態(tài)特征，將供試菌株分成3種類型：菌絲型、孢子型和菌核型。菌絲型有48 個(gè)菌株，生長(zhǎng)初期菌絲從無色到白色，放射狀生長(zhǎng)，3～5 d后可覆蓋全皿，有少量氣生菌絲，培養(yǎng)至15 d 沒有分生孢子或很少有分生孢子產(chǎn)生，沒有菌核產(chǎn)生。孢子型有35 個(gè)菌株，生長(zhǎng)初期菌絲從無色到灰白色，放射狀或放射狀同心圓生長(zhǎng)，3～4 d 后可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，7～10 d時(shí)產(chǎn)生大量氣生菌絲，同時(shí)產(chǎn)生大量分生孢子，以同心圓分布或覆蓋全皿；分生孢子梗蓬松，單生或叢生，具橫隔，多數(shù)在梗中上部任意分支，或頂端任意分支，分支末端膨大，其上著生大量分生孢子，分生孢子形態(tài)可分為近圓形、卵圓形和長(zhǎng)瓜子型，無色至淡褐色（圖3）；培養(yǎng)至15 d 時(shí)沒有菌核產(chǎn)生或產(chǎn)生少量菌核并常被菌絲和孢子覆蓋。菌核型有41 個(gè)菌株，生長(zhǎng)初期菌絲從無色到灰白色，放射狀或放射狀同心圓生長(zhǎng)，3～6 d可覆蓋全皿，有少量氣生菌絲產(chǎn)生；培養(yǎng)至10 d 左右開始產(chǎn)生大量菌核，菌核以同心輪紋狀排列、沿培養(yǎng)皿邊緣分布或散亂分布在培養(yǎng)皿中，其中以同心輪紋狀排列的菌核通常較大；菌核以黑色居多，41 株菌核型菌株中只分離到1 株黃色菌核菌株，菌核大小（1.6～12.3）mm×（1.6～9.9）mm，每皿（32±5）個(gè)菌核；沒有分生孢子或很少有分生孢子產(chǎn)生。

圖1 月季灰霉病癥狀Fig.1 Symptoms of rose gray mold

圖2 云南地區(qū)不同月季灰霉菌培養(yǎng)3、15 d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of different pathogenic fungi of rose gray mold cultured for 3 and 15 days in Yunnan area

2.3 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)88個(gè)代表菌株的ITS、RPB2基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分別得到長(zhǎng)度約為500 bp和1 100 bp的片段，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖4 所示。在GenBank 中利用BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明：87 株菌株的2個(gè)基因片段與B.cinerea基因相似性均在99%以上，1 株菌株（SLJY-BLZ-2）的2 個(gè)基因片段與B.fabae相似性均在99% 以上。將測(cè)得的序列與從GenBank 上獲取的其他葡萄孢屬真菌進(jìn)行ITS和RPB2基因序列分析，并以核盤菌屬（Sclerotinia sclertiorum）和叢梗孢屬（Monilinia fructicola）真菌作為外群構(gòu)建聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：上述87株菌株與B.cinerea聚為一支，SLJY-BLZ-2與B.fabae聚為一支（圖5），自展支持率分別是76%和85%。因此，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，可以確定采集到的88 個(gè)侵染云南地區(qū)切花月季的病原菌為B.cinerea和B.fabae。?

圖3 云南地區(qū)月季灰霉病病原菌的顯微特征Fig.3 Microscopic characteristics of rose gray mold pathogens in Yunnan area

圖4 ITS、RPB2引物對(duì)云南地區(qū)月季灰霉病病原菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of rose gray mold pathogens in Yunnan area by ITS and RPB2 primers

3 討論與結(jié)論

灰霉病是由葡萄孢屬真菌（Botrytisspp.）引起的一類重要病害，Botrytisspp.是一類在世界范圍分布的病原真菌，寄主范圍廣，其中B.cinerea可以侵染586 屬1 400 種植物，其他種的寄主范圍較窄[13]；B. fabae主要侵染蠶豆，也能侵染幾種其他的豆科植物[14]，暫未見到從月季上分離到B.fabae的報(bào)道。本研究從月季切花上分離得到1株B.fabae菌株，這是從月季上分離到B.fabae的首次報(bào)道。

葡萄孢屬真菌屬內(nèi)包含的種比較多，現(xiàn)在國際上廣泛認(rèn)可的是Henneber（t1973）分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)將葡萄孢屬真菌歸納為23 個(gè)種。病原菌的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征和其對(duì)寄主的專性化，但是形態(tài)特征容易因環(huán)境的改變而變化，有些葡萄孢菌寄主范圍比較廣泛，并且屬內(nèi)種與種之間的特征比較相似[15]，單靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法很難準(zhǔn)確鑒定引起月季灰霉病的病原菌。本研究通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)手段鑒定出的B.fabae病菌在菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)及菌落特征上與B.cinerea沒有顯著差異，充分證實(shí)了分子輔助鑒定的必要性。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定方法結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法能更加準(zhǔn)確地鑒定病原菌。ITS區(qū)域已被廣泛地應(yīng)用于真菌種類的鑒別，但因其序列較短且在種內(nèi)不同菌株間高度保守，提供的信息量較少，所以并不能很好地區(qū)分菌株之間的親緣關(guān)系[12,15-16]。STAATS等通過對(duì)葡萄孢屬真菌的功能基因RPB2、HSP60和G3PDH進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，這些基因存在足夠的變異，能夠鑒定形態(tài)學(xué)上無法區(qū)分的葡萄孢屬的23個(gè)種，證實(shí)葡萄孢屬中的23個(gè)種在基因水平上是獨(dú)立的[11]。筆者在初期分析數(shù)據(jù)時(shí)曾單獨(dú)采用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，供試菌株與葡萄孢屬的3 個(gè)種B.cinerea、B.fabae和B.pelargonii聚為一支，其他幾個(gè)種也不能被明顯區(qū)分開。因此，本研究采用ITS和RPB2基因聯(lián)合分析的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：87 個(gè)菌株與B.cinerea聚到單一的進(jìn)化分支中，支持率達(dá)到76%；1 個(gè)菌株與B.fabae聚到一個(gè)分支上，支持率為85%；葡萄孢屬的其他種也都位于不同的分支上，能夠顯著區(qū)分葡萄孢屬的不同種。由此表明，采用保守的ITS序列聯(lián)合特定的功能基因序列分析能更準(zhǔn)確有效地鑒定月季灰霉病病原菌。

圖5 云南地區(qū)月季灰霉病病原分離物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of gray mold pathogens isolated from roses in Yunnan area

本研究分離到的124株菌株中，經(jīng)培養(yǎng)觀察，只有1株產(chǎn)生黃色菌核，并且持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月后，菌核已萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子但仍未變色，這與李娜[8]報(bào)道的黃色系菌株相符，這也是從月季上發(fā)現(xiàn)黃色灰葡萄孢菌菌核的首次報(bào)道?；移咸焰呔谏耸怯珊谏丶坌纬傻?，ZHOU 等[17]對(duì)番茄和草莓上分離到的黃色菌核研究表明，B.cinerea菌核的黑色素形成與環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)。本研究從侵染月季的灰霉病病原菌中分離獲得的B.cinerea黃色菌核菌株，為進(jìn)一步研究B.cinerea的菌核顏色與環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)聯(lián)，以及B.cinerea對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供了材料。

本研究用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的88 個(gè)菌株中有87 株是B.cinerea，只有1 株是B.fabae，可見引起云南月季切花灰霉病的病原菌主要是B.cinerea。然而，B. cinerea在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征表現(xiàn)出豐富的多樣性，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究一致[1,18-20]，可以分為菌絲型、孢子型和菌核型3 種類型[1]，所占比例分別是39%、28%和33%，沒有明顯的優(yōu)勢(shì)類型。張靜[1]、李娜[8]、吳小瑤[20]、黃燕等[21]分別在研究湖北灰葡萄孢菌、湖北保護(hù)地番茄和草莓在葡萄孢菌、廣州園藝作物灰葡萄孢菌株、灰葡萄孢蠶豆分離物的多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，供試菌株可分為菌絲型、孢子型和菌核型，其中菌核型占絕大多數(shù)。本研究結(jié)果與他們的研究結(jié)果不同，造成這種差異的原因可能與菌株的寄主有關(guān)。上述幾位研究者獲得的灰霉菌菌株分別是從蠶豆、番茄、草莓等不同科屬的植物上分離得到的，而本研究的供試菌株都是從切花月季上分離得到的，具體原因有待進(jìn)一步研究。