邱芳芳，劉 松，堵國成*，陳 堅

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

脂肪氧合酶（EC1.13.11.12，LOX）是一類能夠?qū)Ｒ淮呋嘣伙柡椭舅幔ê?1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)）形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物的酶[1-2]。此類酶分子一般含有非血紅素鐵。LOX 作為一種無毒無害的生物制劑，可替代溴酸鉀和苯甲酰過氧化物等化學(xué)增白劑提高面粉白度。此外，LOX 能夠改善面粉筋力，改善面團的水合力，增加面包體積，改善面包質(zhì)構(gòu)。LOX 催化不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物可進一步轉(zhuǎn)化為己醇、己醛、壬烯醛等風(fēng)味化合物。

目前商業(yè)化的LOX 產(chǎn)品由大豆提取。然而，由于大豆中存在多種同工酶，提取法獲得的LOX 產(chǎn)品批次穩(wěn)定性差，不利于最終產(chǎn)品質(zhì)量的控制和大規(guī)模應(yīng)用。目前，大豆、豌豆、人、豬等真核細胞生物來源的LOX 已經(jīng)在大腸桿菌，畢赤酵母或釀酒酵母中獲得活性表達，但胞內(nèi)產(chǎn)酶水平最高僅為4.5 U/mL。最近的報道顯示，魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）LOX 在枯草芽孢桿菌中成功表達，但按標準酶活力定義計算，其胞外LOX 產(chǎn)量僅為0.01 U/mL[2]。本文作者所在團隊將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa BBE）來源的LOX 基因至大腸桿菌（Escherichia coli），首次實現(xiàn)了LOX 在大腸桿菌中的高效分泌[1]。

一般認為，導(dǎo)致重組LOX 的總體表達水平不高的主要原因可能是活性LOX 產(chǎn)生的氧自由基會對宿主細胞產(chǎn)生毒性，進而抑制宿主細胞的生長和重組蛋白合成及分泌[1]。為降解活性氧中間體，細菌會產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）來消除活性氧中間體對細胞的毒害[3-6]。本研究通過共表達P.aeruginosa BBE 來源SOD（sodB、sodM）和E.coli 來源的CAT（katE），以期降低LOX 表達對細胞的毒性，進一步提高其在大腸桿菌中的表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 E.coli Rosetta（DE3）（pET-22b（+）/pre-LOXlox1）（N6）為分泌表達P.aeruginosa BBE來源LOX的重組E.coli Rosetta（DE3）[1]。pRSFDuet-1 為表達載體。E.coli JM109 分別用于基因克隆。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基（TB 培養(yǎng)基）：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油4 mL/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，誘導(dǎo)時培養(yǎng)基中添加終濃度為1 mmol/L 的IPTG 和1.5%（V/V）的吐溫20。

1.1.3 試劑 Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶，限制性內(nèi)切酶，DNA 和蛋白Marker 等購自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。DNA 凝膠回收試劑盒，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，亞油酸為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。其余常用試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的PCR 擴增 設(shè)計合成分別帶有NotⅠ和XhoⅠ兩種酶切位點的SodB、SodM、CAT 引物。以P.aeruginosa BBE 基因組為模板，以P1 和P2為上下游引物擴增5’端帶有NotⅠ和3’端帶有和XhoⅠ兩種酶切位點的sodB 基因；以P3 和P4 為上下游引物，擴增5’端和3’端分別帶有NotⅠ和XhoⅠ兩種酶切位點的sodM基因.以大腸桿菌JM109 基因組為模板，以P5 和P6 為引物，擴增5’端和3’端分別帶有NotⅠ和XhoⅠ兩種酶切位點的katE 基因。PCR 引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.2.2 表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將上述PCR 產(chǎn)物分別克隆至pRSFDuet-1 上的NotⅠ和XhoⅠ之間，分別構(gòu)建得到表達sodB，sodM 和katE 的重組質(zhì)粒pRSF-sodB，pRSF-sodM 和pRSF-katE，3 個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta（DE3）（pET-22b（+）/pre-LOXlox1）感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，再加入1 mL LB 培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布LB 平板（含50 μg/mL 氨芐霉素，10 μg/mL 卡那霉素和34 μg/mL 氯霉素），置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取若干LB 平板單菌落分別接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 μg/mL 氨芐霉素，10 μg/mL 卡那霉素和34 μg/mL 氯霉素），培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，用表1 中的引物進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，以驗證各質(zhì)粒是否已轉(zhuǎn)化成功，并進行測序.PCR 產(chǎn)物純化和凝膠回收按試劑盒說明書進行操作，基因的酶切和連接按試劑說明書進行操作。

1.2.3 共表達N6-B，N6-M 和N6-K 菌株的誘導(dǎo)表達 將表達質(zhì)粒pRSF-sodB，pRSF-sodM 和pRSFkatE 轉(zhuǎn)化至表達LOX 的重組大腸桿菌N6，分別得到菌株N6-B，N6-M 和N6-K。從固體培養(yǎng)基上挑取原始菌株N6 及N6-B，N6-M 和N6-K 的單菌落，分別接種于裝有20 mL LB 的250 mL 三角瓶中，N6培養(yǎng)基中加入50 μg/mL 氨芐霉素（終濃度）和34 μg/mL氯霉素（終濃度），N6-B，N6-M 和N6-K 的培養(yǎng)基中加入50 μg/mL 氨芐霉素（終濃度），34 μg/mL 氯霉素（終濃度）和10 μg/mL 卡那霉素（終濃度），于37 ℃和200 r/min 培養(yǎng)過夜，按1%接種量接入裝有50 mL LB 的500 mL 三角瓶中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600至0.6 左右，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 和終濃度為1.5%的吐溫20，20 ℃誘導(dǎo)70 h[7]。

1.2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 外源基因在工程菌中的誘導(dǎo)表達受到很多因素例如菌株類型，目的基因密碼子優(yōu)化，載體類型，培養(yǎng)基，誘導(dǎo)條件（如誘導(dǎo)劑類型和濃度，誘導(dǎo)時間，誘導(dǎo)溫度）等的影響，因此確定還原酶在N6 中表達的優(yōu)化條件對提高LOX 最終產(chǎn)量具有重要意義[8]。根據(jù)第一步的實驗結(jié)果，選取LOX 酶活最高的N6-M 重組菌株，由于N6-M 中的兩個質(zhì)粒均為T7 啟動子，所以選取誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時菌體濃度兩個因素。采用L12（41×31）正交表，選定誘導(dǎo)時異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）濃度和菌體濃度（OD600）作為考察因子。其中IPTG的濃度為4 水平，OD600為3 水平，進行正交試驗。實驗以誘導(dǎo)30 h 胞內(nèi)LOX 酶活為評價指標，實驗因素水平設(shè)置如表2 所示，選擇最佳條件和水平。

表2 誘導(dǎo)條件正交因素水平表Table 2 Orthogonal factor levels of induction conditions

1.2.5 重組菌株生長測定 將各共表達菌株和對照菌株接種至含有相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，200 r/min，采用比濁法（OD600）測定菌體生長。

1.2.6 酶活檢測 LOX 酶活測定：在25 ℃下和234 nm 條件下以亞油酸為底物，使用Shimadzu UV-2450 分光光度計在線測定吸光值的變化，以吸光值變化曲線穩(wěn)定上升部分的斜率計算酶活[7]。LOX 酶活單位定義：25 ℃下每分鐘催化亞油酸形成亞油酸氫過氧化物（HPOD，ε=25 000 L/（mol·cm））1 μmol所需要的酶量定義為1 個酶活單位（U）。

SOD 酶活測定：鄰苯三酚在堿性條件下的自氧化反應(yīng)生成紅橘酚，同時有O2-產(chǎn)生，鄰苯三酚的自氧化速率與O2-的濃度有關(guān)；SOD 能通過催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng)得到H2O2和O2，來抑制鄰苯三酚的自氧化；檢測鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可得知樣品中的SOD 的含量；故，使用Shimadzu UV-2450分光光度計測定在25 ℃條件下鄰苯三酚在325 nm處吸光值變化曲線的斜率，計算酶活[6]。酶活單位定義：25 ℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需要的SOD 酶量為一個酶活力單位（U）。

CAT 酶活測定：在240 nm 波長下H2O2有強烈吸收；過氧化氫能被過氧化氫酶分解，從而反應(yīng)溶液的吸光值（A240）隨反應(yīng)時間下降，使用Shimadzu UV-2450 分光光度計測定該反應(yīng)體系在25 ℃條件下240 nm 處的吸光值變化，以吸光值變化擬合斜率，計算酶活[6]。酶活單位定義：使0.1 mol/L H2O2在1 min 內(nèi)A240減少0.1 的酶量為一個酶活單位（U）。

為了分析重組菌中SOD 和CAT 的表達情況，將不同時間點取的樣品離心收集菌體，用pH 7.5 的PBS 緩沖液漂洗一遍后重懸，超聲破碎，離心去上清得到胞內(nèi)可溶物質(zhì)。破碎后上清液檢測SOD 和CAT的酶活性。

1.2.7 SDS-PAGE 分析 將不同誘導(dǎo)時間的發(fā)酵液離心，0.5 mL 的菌體用磷酸緩沖液（PBS，pH 7.5）漂洗一遍，然后用1.5 mL PBS 懸浮，超聲破碎10 min，離心取上清。破碎后的胞內(nèi)可溶物質(zhì)和發(fā)酵液上清一起進行SDS-PAGE 分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pRSF-sodB，pRSF-sodM，pRSFkatE 的構(gòu)建

研究顯示，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以降解細胞內(nèi)的活性氧中間體[3-6]。為考察抗氧化酶對LOX 表達的影響，將PCR 擴增得到的P.aeruginosa BBE 超氧化物歧化酶基因sodB 和sodM 以及E.coli 過氧化氫酶基因katE 克隆至pRSFDuet-1，分別得到表達質(zhì)粒pRSF-sodB，pRSF-sodM 和pRSFkatE（圖1）。重組的pRSF-sodB、pRSF-sodM，pRSFkatE 經(jīng)雙酶切后可以分別得到約600、600 bp 和2 400 bp 的DNA 片段。測序結(jié)果顯示DNA 序列無突變，證明重組表達載體構(gòu)建成功，抗性平板上長出的即為陽性克隆。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmids

2.2 抗氧化酶共表達對LOX 表達的影響

將構(gòu)建得到的抗氧化酶表達質(zhì)粒pRSF-sodB，pRSF-sodM 和pRSF-katE（圖1）轉(zhuǎn)化LOX 表達菌N6，分別得到重組菌N6-B，N6-M 和N6-K。將重組菌進行搖瓶發(fā)酵，IPTG 誘導(dǎo)70 h。如圖2 所示，誘導(dǎo)70 h 后，N6、N6-B、N6-M 和N6-K 胞外LOX 酶活分別為10.3，2.9，3.1 和7.1 U/mL，胞內(nèi)LOX 酶活分別為1.5，18.7，25.0 和0 U/mL。因此，N6-B、N6-M 和N6-K 誘導(dǎo)70 h 的LOX 總酶活分別為11.8，21.6，28.1 和7.1 U/mL，其中，N6-B 和N6-M的LOX 酶活分別較對照菌株N6 分別提高的1.8 和2.4 倍，N6-K 較對照菌株N6 下降40%，值得注意的是，當(dāng)IPTG 誘導(dǎo)32 h，N6-M 中胞內(nèi)LOX 酶活達到最大值27.2 U/mL，是N6 胞內(nèi)LOX 酶活的3.1 倍。結(jié)果表明：共表達超氧化物歧化酶能有效促進胞內(nèi)LOX 的高效合成，但降低了其向胞外分泌；共表達過氧化氫酶（katE）抑制了重組菌表達與分泌LOX。

圖2 重組菌發(fā)酵產(chǎn)LOXFig.2 Fermentation production of the LOX by the recombinant strains

為進一步分析LOX 在重組菌N6-B、N6-M 和N6-K 中的表達情況，對其胞內(nèi)可溶物質(zhì)和發(fā)酵液上清液進行SDS-PAGE 分析。如圖3 所示，誘導(dǎo)表達32 h 和70 h 后，N6、N6-B、N6-M 和N6-K 胞內(nèi)均存在70 kDa 條帶，與LOX 的理論分子量一致[1]。其中，N6-M 的LOX 條帶明顯較對N6 相應(yīng)條帶增粗，與酶活測定結(jié)果一致（圖3）。此外，在胞內(nèi)樣品中 未 見SodB（21 kDa）、SodM（22 kDa）和CAT（84 kDa）蛋白條帶，可能這幾種酶表達量不高或者表達后被快速降解。

圖3 SDS-PAGE 電泳分析LOX 與抗氧化酶的共表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of the co-expression of LOX and antioxidase

2.3 重組菌胞內(nèi)抗氧化酶活分析

為了分析重組菌中抗氧化酶的表達情況，測定了破碎后上清液檢測SOD 和CAT 活性。如圖4（a）所示，N6-B 和N6-M 胞內(nèi)SOD 酶活波動較大，但總體上N6-M 中SOD 的酶活明顯高于N6-B 和N6；N6-B 中SOD 酶活總體水平較N6 未見明顯提高，但其酶活較N6 出現(xiàn)更早。研究表明，SOD 的表達受環(huán)境中K+和Ca2+影響較大[3]，整個發(fā)酵周期中伴隨著大腸桿菌的生長和裂解，環(huán)境中的離子濃度會隨菌體變化產(chǎn)生一些波動可能引起了N6-B 和N6-M中SOD 酶活波動。因此，SOD 胞內(nèi)活性的增加可能是LOX 大量累積的重要原因.由圖4（b）可知，在誘導(dǎo)前期N6-K 中CAT 酶活顯著提高，表明CAT 在N6 中也得到了活性表達。但是，N6-K 與N6 中胞內(nèi)LOX 酶活未見明顯差異，胞外酶活有所下降。這說明CAT 活性未對LOX 的表達產(chǎn)生明顯促進作用，可能表達CAT 加重重組菌株表達外源蛋白質(zhì)的負擔(dān)[9]。

圖4 重組菌胞內(nèi)抗氧化酶活Fig.4 Antioxidase activity in recombinant strains

2.4 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

重組蛋白的表達水平在一定范圍內(nèi)與工程菌的生長具有一定的關(guān)聯(lián)性，其依賴于培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成、IPTG 的濃度和誘導(dǎo)時間等因素[9]。因此，確定重組菌株的誘導(dǎo)條件對LOX 的最終產(chǎn)量和工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。根據(jù)第一步的實驗結(jié)果，選擇LOX 酶活力最高的N6-M 重組菌株作為優(yōu)化對象，由于N6-M 中的兩個質(zhì)粒均為T7 啟動子，同時IPTG 存在著潛在的毒性，所以選取誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時菌體濃度兩個因素。由于誘導(dǎo)30 h 胞內(nèi)LOX 已經(jīng)大量積累，所以檢測誘導(dǎo)30 h 細胞破碎后上清中LOX 酶活作為實驗的判斷標準。正交試驗結(jié)果如表3 所示。

分析正交試驗得出以下結(jié)論：1）由極差大小可以直觀判斷出各因素對LOX 酶活的影響主次順序為：誘導(dǎo)時菌體濃度（A）＞IPTG 終濃度（B）。蛋白的表達依賴于足夠量和生長旺盛的菌體，所以重組菌的生長和蛋白的表達在時間上存在差異[8]。重組菌的數(shù)量不足，即菌株處于對數(shù)期前期及對數(shù)期前，能夠表達重組蛋白的菌體不足，重組蛋白的表達量會受到較大影響。2）N6-M 發(fā)酵產(chǎn)LOX 的因素最佳條件組合為：誘導(dǎo)時菌體濃度（OD600）2.5+IPTG 終濃度2.0 mmol/L（即A3B4），胞內(nèi)LOX 酶活為28.8 U/mL，較優(yōu)化前（誘導(dǎo)OD600=0.6，IPTG=1 mmol/L）提高5.88%。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

3 討論

作為典型的過氧化物酶，LOX 在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到人們的日益關(guān)注。LOX 可以對面粉進行漂白，改善面粉筋力，改善面團的水合力，提高面團強度和增加食物風(fēng)味，大豆提取的LOX 各批次之間會有較大差異，因此利用大腸桿菌表達LOX 是工業(yè)化生產(chǎn)穩(wěn)定的LOX 的重要基礎(chǔ)。來源于動物，植物等真核生物的LOX 基因在大腸桿菌[10]、酵母、曲霉等系統(tǒng)中實現(xiàn)了表達。原核LOX 基因研究較少，僅Cyanobacterium、N.punctiforme 及P.aeruginosa 在大腸桿菌系統(tǒng)中得到表達[11]。酵母系統(tǒng)中研究者利用信號肽使LOX 分泌到胞外，簡化了下游操作，但產(chǎn)量十分有限；枯草芽孢桿菌中LOX 胞外產(chǎn)量僅有0.01 U/mL[12-13]，Steczko 在E.coli 表達系中實現(xiàn)了大豆LOX 的胞內(nèi)表達，酶活達到4.5 U/mL[14-15]。但總體而言，LOX 的異源表達的水平偏低。

氧毒性在各種物種中均有發(fā)現(xiàn)，是由分子氧的一價還原產(chǎn)物介導(dǎo)的，包括超氧自由基（O2-），過氧化氫（H2O2）和羥基（OH-）[3]。氧毒性對生物和非生物的威脅可能來自于O2-內(nèi)在和相對選擇性的反應(yīng)性，而且O2-可以通過質(zhì)子化得到氧化性更強的HO2-，或者通過鐵催化的Haber-Weiss 反應(yīng)生成OH·。而LOX 能催化內(nèi)源性化學(xué)物如花生四烯酸的反應(yīng)并伴有活性氧的產(chǎn)生，LOX 還能通過影響細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而激活其他活性氧產(chǎn)生途徑；此外，LOX 還能催化外源化學(xué)物代謝為高活性的自由基中間體而誘發(fā)活性氧的產(chǎn)生。因此，如何降低LOX活性對宿主菌的毒性可能是其高效表達的關(guān)鍵。

SOD 是非常高效的催化劑，25 ℃下速度約為2×109m/s，活化能為26.9 kJ/M[16]。N6 表達的LOX 為銅綠假單胞菌（P.aeruginosa BBE）來源，而P.aeruginosa 中會產(chǎn)生幾種SOD 包括SodB 和SodM，與降解胞內(nèi)活性氧中間體有關(guān)[17]。因此，本研究選擇P.aeruginosa 來源的SodB，SodM 和E.coli 來源的CAT 三種抗氧化酶，構(gòu)建共表達載體，降低N6 中LOX 大量合成對細胞產(chǎn)生的壓力，從實驗結(jié)果來看，共表達SodM 時，N6-M 中LOX 酶活提高最多，是原始N6 的2.4 倍（圖2）。雖然影響外源蛋白在宿主中表達因素還有很多，但本研究為LOX 的異源表達提供了一個方向，降低胞內(nèi)活性氧中間體可能是一種解決方法。

4 結(jié)語

微生物發(fā)酵產(chǎn)品想要成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，發(fā)酵工藝的優(yōu)化是重要的環(huán)節(jié)。本研究通過正交實驗對N6-M 發(fā)酵的菌體濃度和IPTG 濃度兩個條件進行優(yōu)化，實驗結(jié)果表明OD600為2.5 時，添加終濃度為2 mmol/mL 的IPTG 誘導(dǎo)30 h 后胞 內(nèi)LOX 酶活達到28.8 U/mL，與OD6000.6，IPTG 終濃度1 mmol/mL的初始條件相比提高了5.88%。