張騰飛 羅青平 邵華斌 佘治國(guó)

摘要：從嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)的發(fā)生及其分子機(jī)制，嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)影響的生理活動(dòng)等進(jìn)行了介紹，并以重要病原菌單增李斯特菌、鏈球菌等為例，闡述了嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)、代謝、致病性等的調(diào)控作用。以期為解析病原菌的環(huán)境適應(yīng)與致病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新型藥物靶標(biāo)提供幫助。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌;嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng);（p）ppGpp信號(hào)分子

中圖分類號(hào)： ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1007-273X（2019）12-0014-03

嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是細(xì)菌在遭受環(huán)境壓力和營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，由（p）ppGpp合成酶催化合成信號(hào)分子（p）ppGpp，誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。經(jīng)典的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是由氨基酸饑餓引起核糖體在合成蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)生空轉(zhuǎn)反應(yīng)，（p）ppGpp合成酶通過(guò)與核糖體的相互作用感受氨基酸饑餓，合成信號(hào)分子（p）ppGpp，從而引發(fā)細(xì)菌的適應(yīng)性調(diào)控[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)可調(diào)控細(xì)菌多種生理學(xué)功能，例如致病菌的存活、復(fù)制和傳播。因此研究細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)對(duì)于解析細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)與致病機(jī)制與開(kāi)發(fā)新型藥物靶標(biāo)具有重大的意義。

1 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)的產(chǎn)生

早在40多年前，Cashel和Gallant第一次發(fā)現(xiàn)了四磷酸鳥(niǎo)苷（ppGpp）和五磷酸鳥(niǎo)苷（pppGpp），簡(jiǎn)稱為（p）ppGpp類物質(zhì)。當(dāng)在氨基酸饑餓條件下，大腸桿菌的細(xì)胞通過(guò)放射性核酸二維薄層色譜檢測(cè)到了信號(hào)分子，即薄層上的“magic spots”-（p）ppGpp，它是由GDP或GTP從ATP上轉(zhuǎn)移磷酸所合成，與rRNA合成的停止相關(guān)。由于細(xì)菌感應(yīng)應(yīng)激環(huán)境產(chǎn)生信號(hào)分子（p）ppGpp，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身的行為以適應(yīng)環(huán)境，因此（p）ppGpp介導(dǎo)的調(diào)控反應(yīng)被定義為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)[1]。

信號(hào)分子（p）ppGpp的水平由兩類酶控制，這兩類酶分別是只具有合成活性的單功能酶和既能合成又能水解的雙功能酶。雙功能酶的命名目前沒(méi)有明確標(biāo)準(zhǔn)，在大腸桿菌中單功能酶被命名為RelA，雙功能酶被命名為SpoT，或者RSH（RelA/SpoT同源蛋白）被稱為雙功能酶。在大腸桿菌中，單功能RelA蛋白和雙功能SpoT蛋白都能從ATP上獲得磷酸，加載到GDP或GTP上形成ppGpp或pppGpp，但是只有雙功能酶才可以水解（p）ppGpp成GDP或GTP和PPi。大部分革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌和沙門氏菌都編碼RelA和SpoT。如果沒(méi)有SpoT，細(xì)菌則不能降解RelA合成的（p）ppGpp，導(dǎo)致不能減少的核酸積累破壞細(xì)胞的周期調(diào)控。在這些物種中，SpoT的功能一般在缺乏合成活性的ΔrelAΔspoT雙缺菌株[（p）ppGpp0]中被研究。其他的許多致病菌編碼（p）ppGpp的途徑與RelA/SpoT雙酶模式截然不同。例如，結(jié)合分枝桿菌、變形桿菌、布氏桿菌等僅編碼一個(gè)雙功能RSH蛋白，而一些革蘭氏陽(yáng)性厚壁菌門，如鏈球菌、芽孢桿菌等不但可以編碼一個(gè)雙功能RSH蛋白（選擇性稱為Rel或RelA），而且還可以編碼其他一些小的RelA樣的合成小片段蛋白（RelP和RelQ）。另外，伽馬變形菌和霍亂弧菌可以編碼RelV和截?cái)嗟暮铣擅竅2-4]。多種酶的存在致力于信號(hào)分子的合成和水解，說(shuō)明了細(xì)菌進(jìn)化出多種功能機(jī)制來(lái)調(diào)控（p）ppGpp的水平。

2 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)調(diào)控細(xì)菌的多種生理學(xué)功能

（p）ppGpp作為信號(hào)分子促進(jìn)細(xì)菌的適應(yīng)和應(yīng)變能力是其主要功能。為了監(jiān)測(cè)和適應(yīng)自身所處的環(huán)境，細(xì)菌依靠其感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)調(diào)控復(fù)雜的生理過(guò)程。比如，細(xì)菌面對(duì)環(huán)境壓力，更易于調(diào)節(jié)自身的耐受程度和營(yíng)養(yǎng)利用途徑。像所有的微生物一樣，每種病原菌最根本的目標(biāo)都是存活與復(fù)制。然而，為了克服宿主強(qiáng)大的防御機(jī)體，病原菌通常需要被賦予毒力相關(guān)的性能，例如表面附著，細(xì)胞或組織的侵入和傳輸。很多病原菌都有獨(dú)特的毒力傳播途徑和更廣泛的適應(yīng)性途徑，比如抗應(yīng)激能力，通過(guò)調(diào)整特異的調(diào)節(jié)子調(diào)控全局性的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，包括重要的碳源和氮源代謝途徑[5，6]。許多細(xì)菌都是依靠核苷酸分子治愈自身的代謝紊亂和協(xié)調(diào)其生存和毒力的平衡。

在宿主的復(fù)雜環(huán)境中，致病菌改變他們的新陳代謝和所利用的蛋白質(zhì)去響應(yīng)環(huán)境的變化。為了搶占先機(jī)，致病菌可能激活特異的分泌系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器或粘附素等。這樣，毒力因子可以促進(jìn)微生物獲得營(yíng)養(yǎng)，增加自身存活率，調(diào)控宿主細(xì)胞的生物或免疫系統(tǒng)，或讓自己處于更有利的環(huán)境中。為了應(yīng)答環(huán)境，病原菌利用專門的調(diào)節(jié)子改變它們的響應(yīng)方式。許多毒力調(diào)節(jié)子的表達(dá)和激活被融入了（p）ppGpp調(diào)節(jié)的全局性響應(yīng)中，從而耦合了致病菌的代謝狀態(tài)。就其本身而論，細(xì)胞內(nèi)（p）ppGpp水平的調(diào)控對(duì)致病菌的存活、復(fù)制和傳播非常重要。

雙功能（p）ppGpp合成/水解蛋白在革蘭氏陽(yáng)性菌中至關(guān)重要。例如，在金黃色葡萄球菌中，SpoT蛋白的同系物 （稱為RelA）對(duì)金黃色葡萄球菌的體外生存非常重要。厚壁菌門的其他成員依賴嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)調(diào)節(jié)自身的全局性生理變化，這種現(xiàn)象也與致病性相關(guān)，例如在環(huán)境中的持久性和抗生素的耐藥性問(wèn)題。舉例說(shuō)明，能引起肺部炭疽熱并在環(huán)境中長(zhǎng)期存活的炭疽芽孢桿菌依賴relA的存在。醫(yī)院內(nèi)越來(lái)越普遍的艱難梭菌經(jīng)常暴露于抗微生物的試劑中，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)阿莫西林和克林霉素存在時(shí)能夠上調(diào)（p）ppGpp合成/水解酶的表達(dá)。

3 ?多種病原菌中的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)

3.1 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)與單增李斯特菌

單增李斯特菌能夠引起罕見(jiàn)致命的食源性疾病。雖然其感染之后的表現(xiàn)可能僅僅引起非侵入性胃腸炎，但是嚴(yán)重的情況下也可以導(dǎo)致敗血癥和腦膜炎。這種感染可能反映了潛在的病原菌能夠侵入宿主細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞至細(xì)胞的傳播現(xiàn)象。雖然relQ和relP在李斯特菌的基因組中被鑒定，但是迄今為止只檢測(cè)到一個(gè)雙功能酶spoT同系物，稱之為Rel或RelA[7]。單增李斯特菌中的（p）ppGpp可以影響生物被膜的形成，缺失了relA的突變株生長(zhǎng)出現(xiàn)缺陷，粘附表面的能力也降低。當(dāng)單增李斯特菌缺失relA后，表現(xiàn)出在培養(yǎng)的細(xì)胞系中存活能力降低的現(xiàn)象，包括Caco-2腸上皮細(xì)胞和J774. A1巨噬細(xì)胞。而由于單增李斯特菌感染引起的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)目前尚不清楚，已報(bào)道的兩組老鼠感染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了沖突的結(jié)果，因此還需要進(jìn)一步深入研究。單增李斯特菌的relA缺失突變株維持一定的毒力并依然具有（p）ppGpp的合成活性，Taylor等發(fā)現(xiàn)突變株毒力降低可能是由于（p）ppGpp產(chǎn)物的減少。Okada等[8]和Bennett等[9]報(bào)道細(xì)菌單增李斯特菌在肉湯和培養(yǎng)的細(xì)胞系中生長(zhǎng)證明了（p）ppGpp適應(yīng)環(huán)境就像面對(duì)宿主感染一樣。

3.2 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)與化膿鏈球菌

A群鏈球菌（GAS）在人體宿主內(nèi)也能適應(yīng)各種各樣的環(huán)境。GAS被證實(shí)能夠引起各種感染，包括膿包瘡（影響皮膚）、肺炎和腦膜炎，包括分泌酶和外毒素等相關(guān)毒力因子的表達(dá)和其生長(zhǎng)過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)代謝情況息息相關(guān)，特別是對(duì)（p）ppGpp的利用尤為重要[10]。和其他革蘭氏陽(yáng)性菌一樣，化膿鏈球菌有兩個(gè)具有（p）ppGpp合成功能的同源小蛋白R(shí)elQ和RelP以及一個(gè)雙功能蛋白R(shí)elA。 因此GAS也能產(chǎn)生不依賴RelA的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)。雖然細(xì)菌進(jìn)入平臺(tái)期之后，relA的轉(zhuǎn)錄譜上調(diào)了2倍，但是許多研究工作揭示了在氨基酸饑餓的條件下化膿鏈球菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)可以不依賴RelA。這條通路影響了重要毒力基因的表達(dá)。例如調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子RopB，其可以支配分泌蛋白酶外毒素B的speB基因的表達(dá);還能影響雙組份調(diào)控系統(tǒng)covRS的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)溶血素S、鏈激酶和外毒素B的表達(dá);與寡肽吸收和進(jìn)程有關(guān)的因子opp和dpp通透酶系統(tǒng)和pepB基因也受其影響。氨基酸饑餓能誘導(dǎo)fas操縱子調(diào)節(jié)毒力和autoinducer-2蛋白的變化。不依賴relA的基因，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶和至少兩個(gè)毒力基因也受到了影響[11]。

3.3 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)與肺炎鏈球菌

像腸球菌和GAS一樣，α-溶血性鏈球菌，比如肺炎鏈球菌能引起廣泛的組織趨向性，造成心內(nèi)膜炎、中耳炎和菌血癥。在肺炎鏈球菌中，通過(guò)信號(hào)標(biāo)簽誘變篩選鑒定出一個(gè)雙功能rel基因，其在肺炎小鼠模型中對(duì)菌株保持毒力有著非常重要的作用[12]。肺炎鏈球菌還編碼一個(gè)RelQ的同系物，但只能在異源系統(tǒng)中合成（p）ppGpp而不能在其自身細(xì)菌體內(nèi)作用。肺炎鏈球菌菌株D39的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)依賴rel，可顯著誘導(dǎo)ply基因的表達(dá)。ply基因編碼肺炎球菌的溶血素，能夠通過(guò)其細(xì)胞毒性誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌早期感染和侵入肺組織而進(jìn)入血液循環(huán)。缺失ply后，肺炎鏈球菌對(duì)小鼠的毒力顯著減弱。肺部感染缺失rel基因的D39菌株后，缺失株對(duì)小鼠表現(xiàn)為無(wú)毒現(xiàn)象[13]。雖然ply可能受其他一些方式調(diào)控，但是其依賴rel的調(diào)控作用是肺炎鏈球菌調(diào)控毒力的一個(gè)重要部分。

3.4 ?嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)與變形鏈球菌

變形鏈球菌是引起齲齒疾病的重要病原菌。為了適應(yīng)口腔內(nèi)環(huán)境，變形鏈球菌能夠形成生物被膜，抵抗環(huán)境中的不利因素，其對(duì)低pH和流動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)成分具有耐受力。變形鏈球菌中信號(hào)分子（p）ppGpp的代謝也是很復(fù)雜的。該細(xì)菌有三個(gè)（p）ppGpp合成酶，一個(gè)雙功能RelA蛋白和兩個(gè)單功能蛋白，分別是RelQ和RelP酶。當(dāng)細(xì)菌面對(duì)莫匹羅星處理過(guò)的氨基酸饑餓條件時(shí)，與糖代謝、生物被膜和遺傳能力相關(guān)的基因表達(dá)便會(huì)發(fā)生變化。然而，通過(guò)判斷比較野生菌株和relA突變株的應(yīng)答反應(yīng)，研究者發(fā)現(xiàn)其中的一些基因并不依賴RelA蛋白。另一方面，在高濃度的碳水化合物的培養(yǎng)基中relA基因的缺失讓細(xì)菌的生長(zhǎng)受到了限制，一些特定糖底物也受到了異常調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)突變株ΔrelA的生物被膜形成能力更弱，然而缺失了relA之后的生物被膜對(duì)酸的耐受能力增加[14]。關(guān)于這3個(gè)調(diào)節(jié)（p）ppGpp的合成酶之間的聯(lián)系仍然需要更進(jìn)一步的研究。

4 ?展望

由此可見(jiàn)，細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)通過(guò)調(diào)控細(xì)菌的代謝、毒力因子表達(dá)等一系列生理活動(dòng)，影響了細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)能力與致病性，深入研究病原菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，對(duì)解析病原菌的致病機(jī)制，開(kāi)發(fā)靶向藥物具有重要意義，也將是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] POTRYKUS K，CASHEL M.（p）ppGpp： still magical[J].Annual review of microbiology，2008，62：35-51.

[2] MAGNUSSON L U，F(xiàn)AREWELL A，NYSTROM T. ppGpp：a global regulator in Escherichia coli[J].Trends microbiol，2005，13（5）：236-242.

[3] BRAEKEN K，MORIS M，DANIELS R，et al. New horizons for （p）ppGpp in bacterial and plant physiology[J].Trends microbiol，2006，14（1）：45-54.

[4] SRIVATSAN A，WANG J D. Control of bacterial transcription，translation and replication by （p）ppGpp[J].Current opinion in microbiology，2008，11（2）：100-105.

[5] GOERKE B，STULKE J. Carbon catabolite repression in bacteria：many ways to make the most out of nutrients[J].Nature reviews microbiology，2008，6（8）：613-624.

[6] PFLUGER-GRAU K，GORKE B. Regulatory roles of the bacterial nitrogen-related phosphotransferase system[J].Trends microbiol，2010，18（5）：205-214.

[7] LEMOS J A，LIN V K，NASCIMENTO M M，et al. Three gene products govern （p）ppGpp production by Streptococcus mutans[J].Mol Microbiol，2007，65（6）：1568-1581.

[8] OKADA Y，MAKINO S，TOBE T，et al.Cloning of rel from Listeria monocytogenes as an osmotolerance involvement gene[J].Appl Environ Microb，2002，68（4）：1541-1547.

[9] BENNETT H J，PEARCE D M，GLENN S，et al.Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes：identification of the CodY regulon and its role in virulence[J].Mol Microbiol，2007，63（5）：1453-1467.

[10] CHAUSSEE M A，DMITRIEV A V，CALLEGARI E A，et al. Growth phase-associated changes in the transcriptome and proteome of Streptococcus pyogenes[J].Archives of microbiology，2008，189（1）：27-41.

[11] MALKE H，STEINER K，MCSHAN W M，et al. Linking the nutritional status of Streptococcus pyogenes to alteration of transcriptional gene expression：the action of CodY and RelA[J].International journal of medical microbiology：IJMM，2006，296（4-5）：259-275.

[12] HAVA D，CAMILLI A. Large-scale identificationof serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors[J].Mol Microbiol，2002，45（5）：1389-1405.

[13] KAZMIERCZAK K M，WAYNE K J，RECHTSTEINER A，et al. Roles of rel（Spn） in stringent response， global regulation and virulence of serotype 2 Streptococcus pneumoniae D39[J].Mol Microbiol，2009，72（3）：590-611.

[14] LEMOS J A C，BROWN T A，BURNE R A. Effects of RelA on key virulence properties of planktonic and biofilm populations of Streptococcus mutans[J].Infection and immunity，2004， 72（3）：1431-1440.